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食肉由来Enterococcus属菌の疫学的研究
https://az.repo.nii.ac.jp/records/3831
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| 名前 / ファイル | ライセンス | アクション |
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diss_de_otsu0015 (2.8 MB)
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diss_de_otsu0015_jab&rev (422.4 kB)
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| Item type | 学位論文 / Thesis or Dissertation(1) | |||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 公開日 | 2014-01-10 | |||||||||
| タイトル | ||||||||||
| タイトル | 食肉由来Enterococcus属菌の疫学的研究 | |||||||||
| タイトル | ||||||||||
| タイトル | Epidemiological study of enterococci isolated from meat | |||||||||
| 言語 | en | |||||||||
| 言語 | ||||||||||
| 言語 | jpn | |||||||||
| 資源タイプ | ||||||||||
| 資源タイプ | thesis | |||||||||
| 著者 |
石﨑, 直人
× 石﨑, 直人
× Ishizaki, Naoto
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| 抄録 | ||||||||||
| 内容記述タイプ | Abstract | |||||||||
| 内容記述 | 腸球菌はEnterococcus属菌の総称であり、ヒトおよび動物の腸管内に常在する通性嫌気性のグラム陽性球菌である。本菌は食品衛生分野においては、冷凍や加熱に対して大腸菌群のように容易に損傷、死滅しないため、従来から汚染指標菌として位置づけられている。一方、臨床分野ではβ-ラクタム系薬剤やサルファ剤などに自然耐性を示すが病原性は低いと考えられていた。しかし、1980年代後半からバンコマイシン（VCM）に対する耐性を獲得したVCM耐性腸球菌（VRE : vancomycin-resistant enterococci）の出現がヨーロッパで報告され、薬剤耐性菌として注目されるようになってきた。さらに、VRE以外の腸球菌も特に免疫力の低下した易感染者に危害を及ぼす可能性が憂慮されている。腸球菌の中でもEnterococcus faecalisやEnterococcus faeciumは、ヒトの疾病との関わりが考えられる病原因子を保有する株のあることが報告され注目されている。そこで、本菌のヒトへの感染源に関する基礎的研究として、特に国産および輸入鶏肉におけるVREの汚染状況を調べて疫学的解析を行うと共に、国産および輸入食肉（鶏肉）における腸球菌の汚染状況と病原遺伝子検出状況について検討した。その概要は以下の通りである。 1) 東京都内で購入した国産鶏肉56件および輸入鶏肉32件（ブラジル産11件、中国産8件、米国産8件、タイ産5件）の計88件を対象にVREの汚染実態を調べた結果、19件（21.6%）から本菌が分離された。その内訳は、VanA型VREが3件、VanC型VREが16件であった。VanA型VREが分離された鶏肉はいずれも輸入鶏肉で、ブラジル産1件（9.1%）とタイ産2件（40.0%）であった。VanC型VREが分離された鶏肉は、輸入が5件 [中国産1件（12.5%）およびブラジル産4件（36.4%）]、国産鶏肉が11件（19.6%）であった。 2) 分離されたVRE19株について菌種型別を行ったところ、VanA型のブラジル産由来の1株はE. faecium、タイ産由来の2株はE. faecalis、VanC型の16株は全てE. gallinarumであった。 3) VRE19株についてVCMとテイコプラニン（TEIC）の薬剤感受性試験を行い、MIC値を測定した結果、VanA型のVRE3菌株はVCMに対して256mg/ml以上の高度耐性を示したが、TEICに対しては6mg/ml以下の感受性を示した。VanC型のVRE16菌株は、VCMに対して4mg/ml以下の低度耐性を示し、TEICに対しては0.94mg/ml以下の感受性を示すことが明らかになった。 4) これらの菌株について、pulsed-field gel electrophoresis（PFGE）法、random amplified polymorphic DNA（RAPD）法、PCR-restriction fragment length polymorphism（PCR-RFLP）法を用いて分子疫学的解析を行った。ApaIおよびSmaIの制限酵素を用いたPFGE法による解析では、VanA型VREであるタイ産鶏肉由来の2株は類似したパターンを示したが、ブラジル産鶏肉由来株とは異なるジェノタイプの株であることが明らかになった。さらにVanC型VREでは、国産および輸入鶏肉由来株は全て異なったパターンを示した。この様に、ApaIおよびSmaIを用いたPFGE法は疫学解析に有効であることも明らかとなった。 5) 次に、プライマーAP40、AP41、OPA2、OPA3、OPA8、OPA9を用いたRAPD法による分子疫学的解析を行った。VanA型VREであるタイ産鶏肉由来2株は、AP40プライマーでは11本、AP41プライマーでは10本、OPA8プライマーでは4本、そしてOPA9プライマーでは6本のDNA断片が認められる全く同一のRAPDパターンを示した。一方、ブラジル産鶏肉由来のE. faecium 99T7-1株は、AP40プライマーでは5本、AP41プライマーでは6本、OPA8プライマーでは3本、OPA9プライマーでは4本のDNA断片が認められるRAPDパターンを示し、タイ産鶏肉由来の2株とは異なるジェノタイプであることが明らかとなった。VanC型VREのうちブラジル産鶏肉由来4株は、AP40プライマーで3パターン、OPA2プライマーで2パターンにそれぞれ識別され、中国産鶏肉由来株とは異なるパターンを示した。国産鶏肉由来11株は、AP40プライマーで5パターン、OPA3プライマーで10パターンにそれぞれ識別されることが明らかになった。PFGE法同様、RAPD法も疫学解析に有効な方法であることが示唆された。 6) vanAおよびvanC領域を増幅して解析するPCR-RFLP法を用いて解析を行った結果、輸入鶏肉から分離されたVanA型VRE3株は制限酵素BamHI、HincIIおよびPstIで2本、MspIでは5本に切断され、同一のRFLPパターンを示した。VanC型VREは、HincIIでは2本または3本の2群に、MspIでは3本または4本のDNA断片が認められる2群に識別された。SalIでは、16株の全てが2本に切断され同一のパターンを示した。 7) 次に、東京都内で2005年から2006年に購入した国産食肉153件および輸入食肉36件の合計189件を対象に、腸球菌の汚染状況について調べた結果、E. faecalisは国産食肉から113件（73.9%）、輸入食肉26件（72.2%）、E. faeciumは国産食肉13件（8.5%）、輸入食肉3件（8.3%）から分離され、国産食肉、輸入食肉いずれもE. faecalisに高率に汚染されていることが明らかとなった。 8) 食肉から分離された腸球菌についてgelatinase（gelE）遺伝子、aggregation substance（asa1）遺伝子、cytolysin（cyl）遺伝子、enterococcal surface protein（esp）遺伝子の状況をPCR産物の有無により検討した。国産食肉由来のE. faecalisおよびE. faeciumでは、それぞれ97件（63.4%）と1件（0.7%）で、輸入食肉由来E. faecalisでは26件（72.2%）で、4つの遺伝子のうちいずれか1つの遺伝子の増幅されていることが明らかとなった。 9) E. faecalisに認められたPCR産物の増幅により検出された病原遺伝子のうち、国産食肉由来192株ではgelEのみが検出された株が68株、gelEおよびasa1の両遺伝子が検出された株が59株、gelE、asa1およびcylAの3つの遺伝子が検出された株が17株であった。一方、輸入食肉由来50株では、gelEおよびasa1の両遺伝子が検出された株が19株、gelEのみが検出された株が12株であった。 10) gelEまたはcylA遺伝子の検出された株を用いて、PCR産物の増幅による遺伝子の検出とその遺伝子の発現状況を検討した結果、gelE検出株のうちゼラチナーゼ産生性を示したものは、国産食肉では148株中140株（94.6%）、輸入食肉では39株中36株（92.3%）であった。また、cylA検出株のうちcytolysin産生性を示した株は、国産食肉由来の25株中7株（28.0%）、輸入食肉由来の10株中6株（60.0%）であった。この様に、必ずしもPCR産物の増幅による遺伝子の検出とその発現状況は一致しないことが明らかとなった。 11) 次いで、cylA遺伝子が検出された35株について、cylオペロンを構成するcylA, cylB, cylM, cylL_SおよびcylL_L各遺伝子の検出パターンを検討した結果、31株（88.6%）でcylA, cylB, cylMおよびcylL_Lの4つの遺伝子が検出されたが、cylL_S遺伝子はこれら35株ではいずれも認められなかった。なお、4つの各遺伝子のPCR産物の増幅が認められた31株のうち、表現型としてのcytolysin産生株は12株（32.3%）であった。 12) 国産および輸入食肉由来E. faecalisのcylAとespの両遺伝子のPCR産物のPCR増幅による検出率は低いが、これらは他の病原遺伝子のPCR産物の増幅が認められた。また、食肉由来の遺伝子検出の際に、cylAやespのどちらか一つの遺伝子がPCRによって検出される事例が存在したが、文献的には易感染者由来株においても同様の事例が報告されている。 以上の結果から、VanA型VREが輸入鶏肉から分離され、日本国内において汚染鶏肉が流通していることが確認された。さらに、その汚染国は発展途上国の一部の地域に限られていることが明らかになった。また、分離菌株についてPFGE法、RAPD法およびPCR-RFLP法による分子疫学的解析を行った結果、VanA型VRE3株はそれぞれ異なるジェノタイプであり、起源を異にすることが明らかとなった。一方、国産鶏肉からはVanA型VREは検出されなかった。次に、食肉中に分布する腸球菌の病原遺伝子の状況をPCR産物の有無によって検討した結果、国産および輸入鶏肉由来のE. faecalisは、いずれかの病原遺伝子の増幅が高率に認められることが確認された。さらに、食肉およびヒト臨床由来株に共通してcylAまたはesp遺伝子を増幅する菌株が認められた。これらの結果は、食肉を汚染しているVREや腸球菌が、ヒトへの感染源の一つとして関与する可能性を示すものであり、食品衛生上重要な知見であると考えられた。 |
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| Abstract | ||||||||||
| 内容記述タイプ | Other | |||||||||
| 内容記述 | Enterococci is the general term of the genus Enterococcus and is the facultative anaerobic gram positive cocci present in the intestinal tract of humans and animals. Those organisms are hard to damage or kill by freezing or heating, unlike coliforms, therefore, enterococci has been used as an indicator of fecal contamination in food hygiene. Enterococci are naturally resistant to many antimicrobials such as beta-lactams and sulfa drugs, but their pathogenicity in nosocomial infection was thought to be low. In the late 1980s, Vancomycin-Resistant Enterococci (VRE) were reported in Europe, and there has since been a remarkable notice in antimicrobial resistance among enterococci. Recently, enterococci other than VRE have been considered as nosocomial pathogens, especially in immune compromised hosts. Enterococcus faecalis and Enterococcus faecium among the enterococci have been reported and observed to possess virulence factors related with human diseases. The aim of this study was to investigate the presence of VRE and other enterococci in domestic and imported meats, and the virulence gene of isolates as fundamental research regarding the infectious source in individuals with enterococci. In addition, molecular epidemiological analysis of those isolates using Pulsed-Field Gel Electrophoresis (PFGE), Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD), PCR-Restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) was also studied. The summary is as follows. 1) A total of 88 meat samples, including 56 domestic and 32 imported chickens, were investigated for VRE. VRE, including 3 VanA-types and 16 VanC-types, were isolated from 19 samples. VanA-type VRE were detected from 1 Brazilian chicken (9.1%) and 2 Thai chickens (40.0%). VanC-type VRE were detected from 1 Chinese chicken (12.5%), 4 Brazilian chickens (36.4%) and 11 Japanese chickens (19.6%). 2) Among 3 VanA-type VRE, 1 strain from Brazilian chickens was identified as E. faecium, 2 strains from Thai chickens were E. faecalis, and 16 strains of VanC-type VRE were identified as Enterococcus gallinarum. 3) The MIC (minimum inhibitory concentration) of vancomycin and teicoplanin against 19 VRE isolates was studied. Three strains of VanA-type strains were high-level resistant to vancomycin (>256μg/ml) and susceptible to teicoplanin (<6μg/ml). Sixteen strains of VanC-type VRE were low-level resistant to vancomycin (<4μg/ml) and susceptible to teicoplanin (<0.94μg/ml). 4) For the molecular epidemiological analysis of 19 strains of VRE, genetic diversity was studied by PFGE, RAPD, PCR-RFLP. PFGE analysis using restriction enzyme ApaI and SmaI showed that 2 strains of VanA-type VRE from Thai chickens were similar but distinguishable from Brazilian strains. Furthermore, all VanC-type VRE strains isolated from domestic and imported chickens had individual patterns. Those results revealed that PFGE analysis using ApaI and SmaI was an effective method for epidemiological study. 5) Molecular epidemiologic analysis was also performed by RAPD method using 6 kinds of primers, AP40, AP41, OPA2, OPA3, OPA8 and OPA9. Among 3 strains of VanA-type VRE, 2 strains from Thai chickens showed identical RAPD patterns with 4-11 DNA fragments by 4 kinds of primers, respectively. On the other hand, 1 strain from a Brazilian chickens showed a different RAPD pattern. These results indicate different genotypes between strains from Thai and Brazilian chickens. Among 16 strains of VanC-type VRE, 4 strains from Brazilian chickens and 1 strain from Chinese chickens showed different RAPD patterns. Domestic strains had 5 or 10 RAPD patterns with 2 kinds of primers, respectively. Those results suggested that the RAPD method was as effective in epidemiological analysis as the PFGE method. 6) The PCR-RFLP method, which amplifies and analyzes vanA and vanC DNA regions, was performed. Three VanA-type VRE strains showed identical RFLP patterns to DNA of 3 strains cleaved into 2 DNA fragments by restriction enzyme BamHI, HincII and PstI, respectively, and 5 DNA fragments by MspI, respectively. Sixteen strains of VanC-type VRE were cleaved into 2 DNA fragments groups by restriction enzyme HincII, or MspI, respectively, but all 16 VRE strains showed an identical pattern by SalI. 7) A total of 189 meat samples, including 153 domestic and 36 imported meats, purchased in Tokyo between 2005 and 2006, were subjected to the isolation of E. faecalis and E. faecium. E. faecalis was detected from 113 samples (73.9%) of domestic meat and 26 samples (72.2%) of imported meat. E. faecium was detected from 13 samples (8.5%) of domestic meat and 3 samples (8.3%) of imported meat. 8) To study potential virulence factors of those isolates, the presence of genes, i.e. gelatinase (gelE), aggregation substance (asa1), cytolysin (cylA), enterococcal surface protein (esp), was examined by PCR. E. faecalis, which possessed any one of these four virulence genes, was detected from 97 (63.4%) domestic meats and 26 (72.2%) imported meats, whereas E. faecium, which possesses any one of these virulence gene, was detected from only one sample of domestic meat. 9) Among 192 strains from domestic meat, 68 strains detected only gelE, 59 strains detected both gelE and asa1, 17 strains detected three genes such as gelE, asa1 and cylA. Among 50 strains isolated from imported meat, 19 strsins detected both gelE and asa1, and 12 strains detected only gelE. 10) The production of gelatinase or cytolysin in strains harboring gelE or cylA gene were examined. Among gelE possessing strains, 140 (94.6%) of 148 strains from domestic meat and 36 (92.3%) of 39 strains from imported meat produced gelatinase, respectively. On the other hand, among cylA possessing strains, 7 (28.0%) of 25 strains from domestic meat and 6 (60.0%) of 10 strains from imported meat produced cytolysin. There was not always a relationship between gene possession and the expression of the characteristic. 11) The possession pattern of cylA, cylB, cylM, cylL_S and cylL_L genes, which consisted of the cyl operon, was examined for 35 cylA positive strains. Thirty-one strains (88.6%) harbored cylA, cylB, cylM and cylL_L, but no strains harbored cylL_S. Furthermore, among 31 strains possessing the cyl gene, 12 strains (32.3%) produced cytolysin. 12) Although the cylA and esp gene detection ratio in E. faecalis from domestic and imported meat is low, cylA or esp positive strains always detected the other virulence gene simultaneously. In addition, the strains which detected either gene of cylA or esp were isolated from meat, and the similar strains were reported to be isolated from compromised hosts origin. In conclusion, VanA-type VRE were detected from imported chicken although countries exporting VRE contaminated chicken were limited, and the contaminated chicken had already been distributed throughout the country. According to molecular epidemiological analysis using PFGE, RAPD and PCR-RFLP, the three strains of VanA-type VRE isolated from imported chickens had different genotypes and origins. On the other hand, VanA-type VRE was not detected from domestic chicken in these studies. Studies about virulence gene possession in enterococci isolated from meats, E. faecalis from domestic and imported meat, showed several virulence genes at a high rate. Furthermore, cylA or esp gene possessing strains which were recognized in clinical strains were also isolated from meats. These results suggested that VRE and enterococci which contaminate meats have the possibility to be sources of human nosocomial infection, which is an important finding with respect to food hygiene. |
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| 学位名 | ||||||||||
| 学位名 | 博士(学術) | |||||||||
| 学位授与機関 | ||||||||||
| 学位授与機関名 | 麻布大学 | |||||||||
| 学位授与年月日 | ||||||||||
| 学位授与年月日 | 2007-09-26 | |||||||||
| 学位授与番号 | ||||||||||
| 学位授与番号 | 乙第15号 | |||||||||
| 著者版フラグ | ||||||||||
| 出版タイプ | AM | |||||||||
| 出版タイプResource | http://purl.org/coar/version/c_ab4af688f83e57aa | |||||||||
