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アイテム
イヌおよびネコの腫瘍の細胞増殖能に関する免疫組織化学的解析
https://az.repo.nii.ac.jp/records/3339
https://az.repo.nii.ac.jp/records/333922e21413-6d9b-4bac-b3bd-430450ac55e5
| 名前 / ファイル | ライセンス | アクション |
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diss_dv_otsu0410 (30.6 MB)
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diss_dv_otsu0410_jab&rev (417.4 kB)
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| Item type | 学位論文 / Thesis or Dissertation(1) | |||||
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| 公開日 | 2013-02-28 | |||||
| タイトル | ||||||
| タイトル | イヌおよびネコの腫瘍の細胞増殖能に関する免疫組織化学的解析 | |||||
| タイトル | ||||||
| タイトル | Immunohistochemical analysis of cell kinetics of tumors in dog and cat | |||||
| 言語 | en | |||||
| 言語 | ||||||
| 言語 | jpn | |||||
| 資源タイプ | ||||||
| 資源タイプ識別子 | http://purl.org/coar/resource_type/c_46ec | |||||
| 資源タイプ | thesis | |||||
| 著者 |
甲斐, 勝行
× 甲斐, 勝行× 石川, 勝行(旧姓)× Kai, Katsuyuki× Ishikawa, Katsuyuki(former name) |
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| 抄録 | ||||||
| 内容記述タイプ | Abstract | |||||
| 内容記述 | 腫瘍をもつ動物の予後には、様々な因子が複雑に関係しているが、予後を予測することは腫瘍罹患動物の診療の中で非常に重要な事項である。病理組織学的診断は、腫瘍の性状を形態学的に観察した結果であり、臨床における予後判定の重要な要素となっている。しかし、形態学的所見が決定的な判断の根拠となりにくい腫瘍があり、さらに客観的な根拠となり得る指標が求められるようになってきた。腫瘍の特質の一つは、細胞の進行性異常増殖で、その発育の早さや増殖の特性を表す組織内および細胞内物質を、免疫学的染色により解析する組織化学的アプローチ法(細胞動態解析法)は、臨床における腫瘍の予後判定の客観化に大きく貢献すると考えられる。 thymidine誘導体である5-bromodeoxyuridine(BrdU)に対するモノクローナル抗体が開発されたことによって、BrdU免疫染色法は、これまでアイソトープを必要としてきた細胞動態解析法に代わり、DNA合成期(S期)の細胞を正確に検索できる方法として急速に普及した。この方法は、ヒトの腫瘍症例にも応用され、多くの情報が蓄積されて体系的に確立された方法となっているが、イヌおよびネコの腫瘍症例に適用した報告は少ない。 BrdU免疫染色法は非常に鋭敏で正確なS期細胞の検出方法であるが、予め生体にBrdUを投与する必要があり、催奇形性や変異原性の問題を解決できていない。細胞内在性抗原であるKi-67およびproliferating cell nuclear antigen(PCNA)に対するモノクローナル抗体による免疫染色法は、BrdU法におけるような問題点は無く、安全で簡便な細胞動態解析法として広く応用されている。ただし、イヌおよびネコの腫瘍について、BrdUに代表される外来性の抗原を利用したGold Standardな免疫染色法の結果と、Ki-67やPCNAなどの内在性抗原の免疫染色結果とを比較してその相関性を論じた研究は少ない。小動物の腫瘍のKi-67やPCNA免疫染色法の信頼性を確立し、さらに詳細な細胞増殖相の解析を行うためにはこれらを比較検討する必要がある。 著者は、イヌおよびネコにLabeled Streptavidin-Biotinylated Peroxydase(LSAB)法によるBrdU免疫染色法を適用し、増殖細胞標識法の手技など基礎的検討を行った。これを基に、イヌおよびネコに自然発生した腫瘍症例(イヌ30例、ネコ6例、13種類の腫瘍)にBrdU免疫染色法を適用して、その標識細胞の局在と標識率を病理組織学的所見と対比した。これによりイヌおよびネコにおいてもBrdU免疫染色法が十分応用が可能で、ヒトで応用されている場合と同様にイヌおよびネコの腫瘍の成長解析法としても有用であることを明らかにした。その後、全ての症例で追跡調査を行って、BrdU標識率および病理組織学的悪性度と実際の症例の予後との関連性を比較して、BrdU免疫染色法がイヌおよびネコの腫瘍における予後判定に有用であることを証明した。さらにKi-67およびPCNAのモノクローナル抗体を用いた免疫染色を、BrdU免疫染色を実施した腫瘍(イヌ18例、ネコ5例、9種類の腫瘍)に適用し、組織固定法や抗原賦活法の最適化を検討した。BrdU、Ki-67およびPCNAの各免疫染色による標識細胞の局在と標識率、ならびに核分裂指数を比較検討することによって、Ki-67、PCNAおよび核分裂指数とS期の細胞(BrdU標識細胞)との相関性を明らかにすることができた。 イヌおよびネコにおける抗Bromodeoxyuridine(BrdU)モノクローナル抗体標識法の基礎的研究と腫瘍症例における細胞増殖能の解析 イヌおよびネコにおけるBrdU免疫染色法の基礎的研究として、その投与方法と投与量、組織固定法よびDNA変性処理の検討を行った。BrdU溶液をイヌおよびネコの静脈内に3.0mg/kg～83.3mg/kgの範囲で投与したが、特別な副作用も発現せず良好な染色結果が得られた。ヒトではBrdU高用量での長時間投与あるいは反復投与(500～1000mg/day, 5～6週間投与)を行った場合の副作用として、骨髄抑制、白血球減少症、被毛粗剛、脱毛などが報告されているが、著者の選択した単回投与による短時間標識法では、いずれの症例においてもこのような副作用は全く認められなかった。 BrdU免疫染色法のための固定法と固定時間に関しては、1週間以内の70%エタノール固定で良好な免疫染色結果を得た。10%緩衝ホルマリン固定においても、液内で組織を加熱固定することにより、BrdUの抗原性を保存することが可能であり、加熱固定が重要な要素となることが示唆された。6時間以上のホルマリン固定を行った材料では、0.05%protease 37℃ 1分間の処理が抗原賦活に最も効果的であった。また、DNA変性処理としては、4規定塩酸による37℃、30分間処理が、操作も簡便で得られる結果も安定していた。 イヌおよびネコの腫瘍例へのBrdU免疫染色法の適用においても、ヒトの腫瘍と同様に組織学的所見とBrdU標識率が概ね一致した。組織学的に悪性所見を示した腫瘍例は一般にBrdU標識率が高く、その平均値は良性所見を示す腫瘍例の約3.5倍で、悪性腫瘍における成長速度の速さがBrdU標識率により客観的に証明された。しかし、個々の腫瘍ごとにみると標識率にはバラツキがあり、これは同一組織内で、局所的な細胞異型度あるいは分化度の違いを反映していると考えられた。BrdU標識率のばらつきが小さな腫瘍は、良性腫瘍かあるいは組織の構成および分化度が比較的均一な非上皮系腫瘍であり、BrdU標識率のばらつきが大きな腫瘍は、組織の構成および分化傾向が多様な上皮系腫瘍と言うことができる。局所的な標識率の高さはその部位での浸潤性や遠隔転移と関連性がないか、今後さらに検討する必要がある。 BrdU免疫染色法の臨床への応用に際して問題となるのは、BrdUによって求められた標識率が腫瘍の増殖能を忠実に表現しているかということと、予後の推測あるいは治療の選択に役立つ指標となり得るかどうかである。病理診断時より14ヵ月後までの追跡調査では、悪性腫瘍と診断された21症例中13例(61.9%)が腫瘍の転移・再発によって斃死し、いずれも高い標識率を示していた。これに対して、病理診断で良性腫瘍とされた症例はBrdU標識率も低く、15症例中4例(26.7%)が腫瘍以外の原因で斃死したのみであった。このことから小動物の腫瘍においても、BrdU標識率は予後判定の重要な要素となると考えられるが、今後さらに症例を重ね追跡期間を延長して、より多くの症例について、個々の腫瘍型における標識率と生物学的態度、治療反応性、組織学的異型度を比較検討し、総合的な予後との関連性を検討する必要がある。 抗Ki-67および抗Proliferating Cell Nuclear Antigen(PCNA)モノクローナル抗体標識法によるイヌおよびネコの腫瘍の細胞増殖能の解析 ------BrdU免疫染色法と比較して------ 各種の増殖細胞関連抗原を検出する免疫染色法では、各々の至適染色条件を設定することが、染色法の信頼性を高める上で非常に重要である。Ki-67およびPCNA免疫染色法における手技を再検討した上で、BrdU免疫染色法の検索結果と比較検討した。 イヌおよびネコの腫瘍における抗Ki-67モノクローナル抗体ならびに抗PCNAモノクローナル抗体を用いた増殖期細胞の検索では、抗原賦活化処理が不可欠であった。いくつかの抗原賦活法の中ではマイクロウェーブ法が染色性良好であり、抗原賦活処理をリン酸緩衝液またはクエン酸緩衝液中で行えば良好な結果をもたらした。Ki-67およびPCNA免疫染色における組織の固定法に関しては、70%エタノール固定が最も良好な染色結果を示したが、10%緩衝ホルマリンでも加熱固定した材料であれば染色性は良好であり、日常の材料についても適用可能であると考えられた。 Ki-67抗体が反応する抗原の性状は未だ不明であるが、BrdU法の場合のような煩雑な操作が不要であることから、細胞増殖解析の良いマーカーとして様々な腫瘍で検討されている。ヒトの腫瘍におけるKi-67の標識率とBrdUによる標識率は一定の比率で相関するとの報告がある。本研究におけるBrdU標識率とKi-67標識率との関係では、相関係数r=0.96で極めて強い相関が認められた。また、BrdU標識率とKi-67標識率の回帰直線は、Y(Ki-67標識率)=1.3X(BrdU標識率)+5.31となった。つまり、Ki-67免疫染色法を用いることで、S期の細胞数を推測することが可能となり、Ki-67免疫染色法はイヌおよびネコの腫瘍例の細胞動態解析にも非常に有用な手法であった。PCNAはDNAポリメラーゼδのアクセサリータンパク質で、増殖能の高い組織で高濃度に検出されるとされている。BrdU標識率とPCNA標識率における相関係数はr=0.73で相関が認められた。また、BrdU標識率とPCNA標識率の回帰直線は、Y(PCNA標識率)=1.2X(BrdU標識率)+15.42となった。BrdU標識率と核分裂指数との間でも、相関係数r=0.70であり相関が認められた。 以上のように、BrdU免疫染色法をイヌおよびネコの腫瘍に適用して、組織学的悪性度ならびに症例の生存率と良く相関すること、Ki-67やPCNA免疫染色における標識細胞の局在と標識率は、BrdU免疫染色のそれと非常に良く相関することを明らかにし、イヌおよびネコの腫瘍における細胞増殖能の解析と予後判定に重要な根拠を付与した。 |
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| Abstract | ||||||
| 内容記述タイプ | Other | |||||
| 内容記述 | The prognosis of the tumor-bearing animal will depend on the complicated influences of various factors. To treat an animal suffering from neoplastic diseases, it is very important to predict the prognosis of the patient. Histopathological diagnosis depends on the morphologicai features of the tumor and will give very important information to predict the prognosis. But, there are considerable numbers of tumors which require not only morphologic findings but also more information on the biological behavior and/or the responsibility to therapeutic agents to get an accurate basis for the clinical judgment. Increasing cancer patients and the progress in its therapy, veterinary clinicians have to look for the more reliable information other than some arbitrary pathological diagnosis based on routine morphology.One of the most important characteristics of the neoplastic diseases is so-called autonomous growth. Cell kinetic analysis employing immunohistochemical methods will give an objective basis to consider the prognosis of each cancer patient in veterinary oncology. A monoclonal antibody to 5-bromodeoxyuridine (BrdU) which is a thymidine derivative has been developed, and BrdU immunostaining technique is believed to have equal reliability comparing with cell kinetic analysis of methods using isotopes. BrdU immunostaining technique has become a useful widely-used tool for the cell kinetic analysis instead of the isotope methods. BrdU immunostaining technique can precisely detect the cells in S-phase (DNA synthetic period). BrdU immunostaining technique has been applied to characterize the tumor cases in human medicine, and a lot of data has been collected to make a systematic knowledge to judge the prognosis. But, there are a limited number of reports applying this method to analyze the tumor cases in the dog and cat. For BrdU immunostaining technique, it needs pretreatment to give it for living body, while it can provide a very accurate data on cells in DNA synthetic period. BrdU immunostaining is a good technique to analyze DNA synthesis, but there remains an important question whether this chemical will be free from teratogenicity or mutagenicity for the living individuals and this question has note been answered yet. Following BrdU method, anti- Ki-67 or anti-proliferating cell nuclear antigen (PCNA) have been developed and utilized in the progression of immunohistochemistry. These antigens are normal substances in the living cells, so they does not cause the troubles on teratogenicity or mutagenicity in the patients, although their detecting phases in the cell cycle are not the same as in previous methods. There are only a few papers on canine and/or feline neoplastic diseases describing the results of Ki-67 immunostaining and/or PCNA immunostaining compared with those of the Gold Standard methods such as BrdU immunostaining or methods using radioisotopes. In order to compare and confirm the reliability of Ki-67 and/or PCNA immunostaining for cell kinetics in these species, further investigations were necessary to reveal the relationships among them. The author carried out several investigations to clarify these problems: At first, application of BrdU immunostaining technique visualized by the Labeled Streptavidin-Biotinylated Peroxidase (LSAB) to the normal tissues of dogs and cats was tested. Then, this method was applied to spontaneous neoplasms in these animals. Thirty canine and 6 feline cases bearing 13 different spontaneous tumors were given BrdU and evaluated for determining the localization of marked cells and labeling index by BrdU immunostaining technique to compare with histopathological findings. BrdU immunostaining labeled the canine and feline cells in proliferating phase as well as similar states of human cells and showed efficacy to analyze the cell kinetics among them. The author also carried out the follow-up study of all cases to compare the results of cell kinetic analysis, histopathological diagnosis and prognosis and concluded this BrdU immunostaining had an efficacy to predict the prognosis of his own clinical cases. The author's study using his own clinical cases spent a lot of time. During the study over 10 years, newly developed immunostaining methods using PCNA and Ki-67 became more popular without basic researches on canine and feline tumors. Therefore, these immunostaining methods were applied to the same cases composed of 18 dogs and 5 cats suffering from 9 neoplasms that had been evaluated by BrdU immunostaining and checked appropriate fixative, fixation time, and antigen retrieval. Comparing the localization of labeled cells, labeling index and mitotic index revealed relationships among the cells of S-phase (BrdU labeled cells), cells labeled with Ki-67 and PCNA. Basic study on anti-Bromodeoxyuridine (BrdU) monoclonal antibody labeling method in normal tissues and the analysis of the tumor cell growth in dogs and cats. The route of administration and dose,fixation and how to denature the DNA were examined to obtain the basic data for BrdU immunostaining technique. BrdU solution was given ranging 3.0 to 83.3 mg/kg by single intravenous injection, but no special side effects were observed and obtained good staining results, while human patients showed side effects as bone marrow suppression, leukopenia, rough hair or alopecia following at high dose and repeated administration (500 to 1000mg/day for 5 to 6 weeks). On fixatives and fixation time,immunostainig result was good under 70% ethanol fixation within 1 week. It was possible to reserve the antigenesity of BrdU in 10% neutral buffered formalin solution, if the tissues were heated in the fixative solution. If one wants to use formalin solution, heating will be a very important factor. For antigen retrieval for the material fixed over 6 hours in formalin, it was most effective to treat with 0.05% protease at 37°C for 1 minute. And for DNA denaturation, it was easy and stable to treat with 4 regulation hydrochloric acid at 37 degree centigrade for 30 minutes. BrdU labeling index and histopathological findings were in good accordance in the most of tumor cases in dogs and cats as well as in humans. Generally the BrdU labeling index of the tumor with malignant histopathology was high and the average of labeling index of malignancy was 3.5 times of those of benign tumors. Rapid growth was proved objectively by BrdU labeling index. But, BrdU labeling index was varying in individual tumor, probably reflecting the presence of foci with different cellular atypia or levels of differentiation. Narrow range of fluctuation in BrdU labeling were seen in parimarily benign and/or nonepithelial tumors with rather equal differentiation. Wide or highly fluctuating BrdU labeling were seen in epithelial tumors composed of numerous components or with multiple levels of differentiation.Further investigation will be necessary to reveal whether local high BrdU labeling index would reflect local invasion or distant metastasis. For veterinary clinicians,it might be most important whether the labeling index of BrdU immunostaining would properly reflect the true growth rate, suggesting the prognosis and choosing therapeutic methods. The author planned and traced the clinical course of canine and feline patients suffered from neoplastic diseases after the confirmation of histopathological diagnosis.During the follow-up study, 13 cases out of 21 malignant neoplasms (61.9%) died of reccurrence and/or metastasis of the tumor within 14 months and each case showed high labeling index.On the contrary, benign neoplasms diagnosed histopathologically showed low labeling index and 4 cases out of 15 (26.7 % )died of other than neoplastic diseases in the same period. These facts suggested BrdU labeling index would be a very important prognostic factor for the neoplastic diseases among dogs and cats. Further investigation of number of accumulated cases and prolonged duration of following-up would provide prognostic informations on each type of tumor, biological behavior, responsibility to therapy relating to histopathology. Proliferation analysis of tumors in dogs and cats employing anti-proliferating cell nuclear antigen (PCNA) and Ki-67 monoclonal antibody immunostaining. In comparison with the --- BrdU immunity staining technique, --- It is essential for keeping the reliability to search and establish the suitable staining conditions for the methods detecting the proliferation rate using antibodies relating the cell growth. The author checked and studied the best way for immunostaining using anti-PCNA and Ki-67 monoclonal antibodies and compared the results of these staining with BrdU labeking.Antigen retrieval was necessary for these two antibodies to detect the proliferating cell nuclei.Among several antigen retrieval methods, microwave heating in the phoshate buffer or citrate buffer yielded good results.For anti-PCNA and Ki-67 immunostaining, 70% ethanol fixation gave the best staining results. It was also possible to obtain similar results using 10% neutral buffered formalin fixation acceralated by heating.Although the nature of epitope for anti-Ki67 antibody was still obscure, it needs no complicated procedures as in BrdU method. So, anti-PCNA and Ki-67 antibodies are believed to be a good tool to analyze proliferating cells.There is a report on the correlation of the labeling index of Ki-67 and BrdU in the human tumors. The author obtained very good correlation between the labeling index of the Ki-67 and BrdU labeling index in this research and the coefficient of correlation r=0.96. The regression line of the labeling index of the Ki-67 and BrdU became Y (Ki-67 labeling index) =1.3X (BrdU labeling index) +5.31.Therefore, it was possible to count the cells of the DNA synthetic period by using Ki-67 immunostaining technique, and Ki-67 immunostaining seemed to be very useful for the cell kinetic analysis of the tumor of dogs and cats. PCNA is thought to be accessary protein of the DNA polymerase δ and detected in the high concentration in the tissues having high growth activity. Correlation was recognized as the coefficient of correlation in the BrdU labeling index and the PCNA labeling index with r=0.73.And, the regression line of the BrdU labeling index and the PCNA labeling index became Y (PCNA labeling index) =1.2X (BrdU labeling index)+15.42.BrdU labeling index and mitotic index was a coefficient of correlation r=0.70, and correlation was recognized. Conclusively, BrdU immunnostaining technique was applicable for canine and feline neoplasms.BrdU laveling index had a good corrlation to the grading of histopathological malignancy, and survival rates. Ki-67and PCNA immunostaining labeled proliferating cells in a good correlation to BrdU method.These facts provided a important basis to analyze the proliferating activity and predict the prognosis for neoplastic diseases in dogs and cats. |
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| 学位名 | ||||||
| 学位名 | 博士(獣医学) | |||||
| 学位授与機関 | ||||||
| 学位授与機関名 | 麻布大学 | |||||
| 学位授与年月日 | ||||||
| 学位授与年月日 | 2007-01-29 | |||||
| 学位授与番号 | ||||||
| 学位授与番号 | 乙第410号 | |||||
| 著者版フラグ | ||||||
| 出版タイプ | AM | |||||
| 出版タイプResource | http://purl.org/coar/version/c_ab4af688f83e57aa | |||||
