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アイテム
核酸拮抗物質の抗ニワトリコクシジウム活生に関する研究
https://az.repo.nii.ac.jp/records/3218
https://az.repo.nii.ac.jp/records/32186fc95d76-3110-4437-83cc-88c07f1843a8
| 名前 / ファイル | ライセンス | アクション |
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diss_dv_otsu0310 (8.5 MB)
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| Item type | 学位論文 / Thesis or Dissertation(1) | |||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 公開日 | 2013-02-05 | |||||||||
| タイトル | ||||||||||
| タイトル | 核酸拮抗物質の抗ニワトリコクシジウム活生に関する研究 | |||||||||
| タイトル | ||||||||||
| タイトル | Studies on the anticoccidial activity of nucleic acid antagonists | |||||||||
| 言語 | en | |||||||||
| 言語 | ||||||||||
| 言語 | jpn | |||||||||
| 資源タイプ | ||||||||||
| 資源タイプ | thesis | |||||||||
| 著者 |
松野, 年美
× 松野, 年美
× Matsuno, Toshimi
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| 抄録 | ||||||||||
| 内容記述タイプ | Abstract | |||||||||
| 内容記述 | ニワトリコクシジウムのうち病原性の強い代表種としてEimeria(E.) tenella，E. necatrix，E. acervulina，E. maximaおよびE. brunettiがあげられる。これらが宿主ニワトリに与える障害性により，家禽産業に重大な被害を与えてきた。一方，コクシジウム症の予防・治療の目的のため，これまで国内で飼料添加剤として取り扱われてきた薬物にはnicarbazin，zoalene，amprolium，decoquinate，clopidol，robenidine，monensinおよびhalofuginoneなどがある。しかし，これらの飼料添加剤の多くはすでに耐性の発現，その他の欠点(例えば常用量が毒性発現域に近い，常用量でオーシストの産生を阻止できない，スペクトラムが狭い，休薬後に再発，残留性がある)などにより，強い抗原虫効果と飼料の有効利用に基づく経済的有用性の双方を満足できるものではなくなっている。そこで，新たに開発された核酸前駆物質誘導体には抗原虫活性の強いことが示唆されていたことから，新しいタイプの抗コクシジウム薬としての条件を備えているものと考え，核酸合成拮抗物質の抗コクシジウム活性に関する研究を実施した。 第I章として，まずピリミジン誘導体および関連化合物の抗コクシジウム効果について追究した。すなわちピリミジン環を有する核酸構成成分のうち，ウラシル，ウリジンが圧倒的にコクシジウム原虫に取り込まれること，一部シチジンが取り込まれる事実に基づき，それらの類縁化合物の抗コクシジウム活性について検討した。 1. 14種のウラシル関連化合物，5種のシトシン関連化合物，6-アザウラシル(6-AzaU)および6-AzaU誘導体につきE. tenellaに対する活性を調べた結果，5-フルオロウラシル(5-FU)は飼料中375ppm，5-フルオロウリジン(5-FUR)は31.2ppm，5-フルオロデオキシウリジン(5-FdUR)は375ppm，6-AzaUは500ppmでコクシジウムの発育抑制効果を示し，6-AzaU誘導体VM-3032，VM-7205にも強い抗コクシジウム活性のあることが判明した。しかし，その他の化合物には抗E. tenella効果は認められなかった。次にE. tenella以外のニワトリコクシジウムに対する活性を検討したが，活性を示した化合物は2種のみで，5-FUがE. acervulina対し125ppmで，また，6-AzaUが1,000ppmでE. necatrixに対し発育抑制効果を示した。一方，抗コクシジウム活性を示す化合物のうち，6-AzaUおよびその誘導体(VM-3032，VM-7205)以外の物質ではニワトリの増体重が低下する副作用のあることを明らかにした。 2. 同じくウラシルの類縁化合物でピラジン環を有する天然物エミマイシンおよびその誘導体エミマイシン・リボシドならびにカルボキシ・エミマイシンの抗コクシジウム活性について調べた。すなわち，エミマイシンはE. tenellaに対して飼料中500ppmで優れた発育抑制効果を示した。エミマイシン・リボシドはE. tenella，E. necatrix，E. acervulina，E. maximaおよびE. brunettiに対して飼料中16ppm以上の濃度で発育を阻止した。また，このエミマイシン・リボシドはE. tenellaを用いたin vitroの試験において，第1代および第2代シゾゴニー期に作用することを究明し，加えてBHK-21細胞を用いたin vitroの試験でE. tenellaに対する最少発育阻止濃度は培地中0.1μg/mlであること，および殺原虫的作用のあることを明らかにした。一方，カルボキシ・エミマイシンはE. tenella，E. necatrixおよびE. maximaに対し，飼料中125ppmで優れた発育抑制効果を発揮したが，E.acervulinaに対しては250ppm以上で効果を示した。また，このカルボキシ・エミマイシンは作用時期に関するin vivo，in vitroの試験成績から，E. tenellaの第1代，第2代シゾゴニー期およびガメトゴニー期の原虫に対し有効であることが判明した。このようにエミマイシン・リボシドおよびカルボキシ・エミマイシンの抗コクシジウム活性ついて，その有効コクシジウム種，用量および作用時期を初めて明らかにした。 3. 前述の試験で抗コクシジウム活性の判明した化合物のうち，5-FUおよびエミマイシンはウラシルの拮抗物質，エミマイシン・リボシドはウリジンの拮抗物質であること，また，6-AzaUおよびカルボキシ・エミマイシンはオロチン酸の拮抗物質であることが，すでにそれらの抗菌活性に関する研究から知られている。そこで，これらの化合物のコクシジウムに対する作用機序を検討するため，E. tenellaを用い同様の拮抗現象が発現するか否かを調べた。すなわち，それぞれの薬物投与と同時に，種々な核酸構成成分ないしその前駆物質(ウラシル，ウリジン，オロチン酸，シトシン，シチジン，チミン，アデニン，アデノシン，グアニンなど)を投与し，各薬物の抗E. tenella活性が拮抗的に低下するか否かを試験した。その結果，活性の低下見られた化合物はいずれもオロチン酸アンタゴニストとして知られている6-AzaUとカルボキシ・エミマイシンの2種であった。前者はオロチン酸とウリジン，後者はオロチン酸とアデニンによりいずれもE. tenellaに対する抗コクシジウム活性が競合的に低下した。とくに，カルボキシ・エミマイシンがピリミジン誘導体とプリン誘導体の両者により拮抗されたことは，この化合物がピリミジンおよびプリン双方の代謝を阻害する作用のあることを示唆するものであり，初めて明らかにされた知見である。また，この知見からE. tenellaの核酸代謝がオロチン酸とアデニンの位置で(ピリミジンとプリンの代謝が)同種の酵素により司られている可能性を示唆しているものと考えられる。その他のウラシルおよびウリジン類縁化合物には，どの核酸構成成分の同時投与によってもその影響は認められなかった。 第II章ではプリン誘導体および核酸代謝阻害に関連する化合物の抗コクシジウム効果について追究した。すなわち，原虫がプリンの自己合成を行わず，外部からの取り込みに依存しているといわれていることに注目し，プリン誘導体の中から，新しい抗コクシジウム薬を発見することを目的として，プリン誘導体29種のスクリーニングおよび抗コクシジウム活性の高い化合物の薬効評価試験，耐性発現性試験を行った。また，自体核酸構成成分の誘導体ではないが，8-アミノキノリン，およびサルファ剤とジアミノピリミジンの合剤など核酸代謝阻害に関わる化合物の抗コクシジウム活性についても併せて検討した。 1. E. tenellaを用いて29種のプリン誘導体のスクリーニングを行った結果，活性を示した化合物はキサンチン誘導体3種，アデニン誘導体4種で，それぞれ125ppmにおいて弱い活性を示した。次に10種の9-(置換ベンジル)アデニン誘導体につき，同じくE. tenellaに対する活性を調べたところ，6種の化合物に飼料中125ppmで強い活性が見られた。そこで，6種の化合物中とくに強い活性とより広い安全域を有するものと推測された2種の化合物，9-(2-chloro-6-fluorobenzyl)-6-aminopurine(VM-6387)および9-(2-chloro-6-fluorobenzyl)-6-diaminopurine(VM-6736)を選び同種既知化合物であるarprinocidと薬効の比較試験を行った。各被験薬物の5種のニワトリコクシジウムに対する抗コクシジウム作用をニワトリの一般的な症状発現の抑制効果を指標として判定した有効濃度はVM-6387が60-100ppm，VM-6736が70-110ppmおよびarprinocidが60-70ppmであった。しかし，この有効濃度のうちE. tenella感染に対する作用として，産生されたオーシストのスポロゾイト形成を完全に阻止し，かつ，非感染非投薬対照群と同等の増体効果の得られた有効濃度はVM-6387が90-100ppm，VM-6736が90-110ppmであったのに比べ，arprinocidではそのような有効域は得られなかった。また，各薬物の活性は共通してE. maxima>E.acervulina>E. tenellaに対する順に強く，かつ，いずれの薬物もオーシストのスポロゾイト形成を強く抑制することで，他の種の抗コクシジウム薬には見られない特徴的な活性のあることを明らかにした。また，VM-6387のE. tenellaに対する作用時期は第1代および第2代シゾゴニー期およびガメトゴニー期に作用することを究明した。さらに，この化合物(VM-6387)に対するE. tenellaの耐性獲得性に関する実験を行った結果，arprinocidについて知られているよりも遅い10代継代目に耐性が獲得されることを観察した。これらの試験成績は，VM-6387およびVM-6736はarprinocidとほぼ同様の抗コクシジウム作用を有し，しかも野外において使用された場合，VM-6387はarprinocidに比べ耐性発現をより許しにくい性質を備えていることを示唆している。 2. 自体核酸構成成分の誘導体ではないが，pamaquine，primaquineなどはマラリアに対しピリミジン合成経路のジヒドロオロチン酸の代謝を阻害することが知られていることから，8-アミノキノリン類の抗コクシジウム活性について検討した。pamaquineは飼料中125-250ppm，primaquineは62.5-250ppmでE. tenellaに対し強い抗コクシジウム作用を示し，また，E. necatrixに対しては前者が250ppmで中程度の抗コクシジウム作用を示した。しかし，E. acervulina，E. maxima，およびE. brunettiに対してはpamaquineおよびprimaquineとも無効であった。最後に，サルファ剤(sulfadimidine:SDD)と葉酸拮抗物質(2，4-diamino-5-(8-dimethylamino-7-methy-5-quinolylmethy1)pyrimidine:BQP)の9:1の比による合剤の抗コクシジウム効果について調べた。前者は単独では飼料中2,000ppm，後者は1,000ppmでE. tenellaに対し有効に作用したが，合剤とした場合にはE. tenellaに対し337.5+37.5ppm，E. necatrixには450+50ppm，E. acervulinaおよびE. brunettiには225+25ppm，E. maximaにはE. maximaには112.5+12.5ppmが最少有効濃度であった。この相乗効果は同種の薬剤(例えばsulfaquinoxaline+diaveridine，sulfamonomethoxine+ormetoprim，sulfadimethoxine+trimethoprimなど)につきすでにいわれているように，テトラヒドロ葉酸に至る葉酸合成経路が異なる2点でブロックされることによる相乗作用に基づくもので，最終的にはメチル基供与が断たれることにより核酸代謝の阻害に至るものと思われる。また，本試験成績に示したそのスペクトラムはプリン誘導体のそれに近いものであった。このようにSDDとBQP合剤の抗コクシジウム効果を初めて明らかにした。 以上，ニワトリコクシジウムのうちE. tenellaおよびE. necatrixはオロチン酸代謝阻害に対し極めて敏感に反応するが，E. acervulina，E. maximaおよびE. brunettiではオロチン酸代謝の阻害に低反応を示したことから，オロチン酸代謝拮抗物質(ないしそのことが最も示唆された薬物)6-AzaU，カルボキシ・エミマイシンおよび8-アミノキノリンは，E. tenellaおよびE. necatrixに対し，強い抗コクシジウム薬になることを立証した。また，5種のコクシジウムは共通してウリジンの代謝阻害に対し，強い影響を被り易いことを明らかにし，ウリジン代謝拮抗物質(エミマイシン・リボシド)はE. tenella，E. necatrix，E. acervulina，E. maxima，E. brunettiに対し，効果的な抗コクシジウム薬となり得ることを証明した。さらに，ウラシル(5-FU，エミマイシン)，プリン(VM-6387，VM-6736)および葉酸代謝拮抗物質合剤(SDD:BQP=9:1)は3種の小腸コクシジウム(E. acervulina，E. maxima，E. brunetti)に対し，E. tenellaあるいはE. necatrixに対する作用よりもさらに強い抗コクシジウム効果のあることを明らかにした。 |
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| Abstract | ||||||||||
| 内容記述タイプ | Other | |||||||||
| 内容記述 | Among avian coccidian, Eimeria(E.) tenella, E. necatrix, E. acervulina, E. maxima and E. brunetti represent highly pathogenic species. They cause serious losses in the poultry industry due to the damages they give to the host birds. Nicarbazin, zoalene, amprolium, decoquinate, clopidol, robenidine, monensin, and halofuginone have been used in Japan as feed additives to prevent and treat coccidiosis. Because of the development of the resistance and other defects such as narrow safety margin, incomplete inhibition of oocyst production at the use level, narrow spectrum, recurrence after withdrawal of the drug, tissue residue problem, most of these feed additives, however, can no longer satisfy the requirements for both strong antiprotozoal efficacy and economical usefulness based on the effective utilization of feed nutrients. Since a strong antiprotozoal effect had been suggested in some newly developed nucleic acid antagonists, they might satisfy the requirements for the new-type anticoccidial drugs. From this point of view the present studies were under taken on the anticoccidial activity of antagonists to the nucleic acid components. In Chapter I, anticoccidial activities of pyrimidine derivatives and their analogues were studied. Based on the fact that, among nucleic acid component pyrimidines, uracil and uridine are overwhelmingly incorporated into the coccidial protozoa with cytidine being partially incorporated, anticoccidial effects of these analogues were studied. 1. Fourteen uracil derivatives, five cytocine derivatives, 6-azauracil (6-AzaU) and 6-AzaU derivatives were tested for their efficacy against E. tenella. As the result, 5-fluorouracil (5-FU), 5-fluorouridine (5-FUR), 5-fluorodeoxyuridine (5-FdUR) and 6-AzaU inhibited the growth of coccidia at 375, 31.2, 375 and 500 ppm in feed, respectively. 6-AzaU derivatives, VM-3032 and VM-7205, also showed a strong anticoccidial effect. No other compounds, however, showed an anticoccidial effect against E. tenella. Then, their anticoccidial activities against chicken coccidia other than E. tenella were studied. Only two compounds, 5-FU and 6-AzaU showed activities, i.e. 5-FU exhibited an inhibitory effect against E. acervulina at 125 ppm and 6-AzaU showed activity against E. necatrix at 1000 ppm in feed. Among the compounds that showed anticoccidial activity, those excluding 6-AzaU and its derivatives (VM-3032 and VM-7205) also showed a tendency to decrease body weight gain of birds. 2. Anticoccidial activities of emimycin, a natural product of a uracil analogue with a pyrazine ring, and its derivatives, emimycin riboside and carboxyemimycin, were examined. Emimycin exhibited a potent inhibitory effect against E. tenella at 500 ppm in feed. Emimycin riboside inhibited the growth of E. tenella, E. necatrix, E. acervulina E. maxima and E. brunetti at above 16 ppm in feed. In an in vitro test using E. tenella, emimycin riboside showed the effect against E. tenella on stages of the first and the second generation schizogony. In an in vitro test using BHK-21 cells, this compound showed coccidiocidal effect against E. tenella at minimum inhibitory concentration of 0.1μg/ml. Carboxyemimycin, on the other hand, exhibited a potent inhibitory effect against E. tenella, E. necatrix and E. maxima at 125 ppm in feed, while it required the concentrations of above 250 ppm in feed against E. acervulina. From the in vitro and in vivo experiments on the mode of action of carboxyemimycin, it was elucidated that this compound acts on stages of the first and the second generation schizogony and the gametogony of E. tenella. The present study thus disclosed the susceptible coccidial species and stages, and the effective dosage of emimycin riboside and carboxyemimycin. 3. Among those compounds whose anticoccidial activities were identified in the above-mentioned studies, 5-FU, emimycin, 6-AzaU and carboxyemimycin have been known as uracil and orotic acid antagonists, respectively, from the studies on their respective antibacterial and/or anticancerous activities. In order to study the anticoccidial mode of action of these compounds, the presence or absense of similar antagonistic effects was investigated with E. tenella. Each compound was administered to E. tenella infected chickens together with various nucleic acid components or the precursor(uracil, uridine, orotic acid, cytocine, cytidine, thymine, adenine, adenosine, guanine, etc.) and the reduction of the inhibitory effect of each compound against E. tenella by simultaneous administration of those nucleic acid components or the precursor was examined. As the result, the compounds whose activity was reduced were 6-AzaU and carboxyemimycin, both of which are known as orotic acid antagonists. Anticoccidial activity of the former against E. tenella was reduced competitively by orotic acid and uridine, while that for the latter was reduced by orotic acid and adenine. In particular, the fact that carboxyemimycin was antagonized by both a pyrimidine precursor and a purine nucleic acid component indicates that this drug may have an inhibitory effect on the pyrimidine and purine metabolism, which is a novel finding. From this finding, it was also considered that the pyrimidine and purine metabolism of E. tenella is possibly regulated by a similar enzyme at the positions of orotic acid and adenine. Other uracil or uridine analogues were not influenced by the simultaneous administration of any nucleic acid components or the precursor. In Chapter II, anticoccidial activities of purine derivatives and those compounds with inhibition of nucleic acid metabolism were studied. From the fact that all protozoan parasites do not synthesize purines by themselves and rely on the uptake from the exogenous sources, twenty-nine purine nucleic acid derivatives were screened using E. tenella and some potent compounds were further evaluated for the efficacy and investigated the development of the resistance, in order to discover a novel anticoccidial drug. Anticoccidial activity was also studied of such compounds as 8-aminoquinoline and combination of sulfonamide and diaminopyrimidine which themselves are not derivatives of nucleic acid components but are involved in the inhibition of the nucleic acid metabolism. 1. As the result of screening of twenty-nine purine derivatives with E. tenella, three xanthine and four adenine derivatives exhibited a weak activity at 125 ppm in feed. Then, ten 9-(substituted benzyl)-adenine derivatives were examined for the activity against E. tenella and six compounds exhibited a potent activity at 125 ppm in feed. Among these six compounds, two compounds, 9-(2-chloro-6-fluorobenzyl)-6-aminopurine(VM-6387) and 9-(2-chloro-6-fluorobenzyl)-6-diaminopurine(VM-6736), were selected as those having a particularly potent activity and wider safety margin, and their efficacy was compared with that of arprinocid, a known compound in this group. Effective doses of VM-6387, VM-6736 and arprinocid against five species of chicken coccidia based on the inhibition of general coccidial symptoms were 60-100 ppm, 70-110 ppm and 60-70 ppm, respectively. Among these dose ranges, however, the effective doses which completely inhibited the sporulation of the oocysts and produced similar body weight gain to that of the uninfected unmedicated control group were 90-100 ppm and 90-110 ppm for VM-6387 and VM-6736, respectively, while such dose could not be established for arprinocid. Activities of each compound against various coccidial species were commonly greater in the order of E. maxima, E. acervulina and E. tenella, and all compounds strongly inhibited the sporulation of oocysts, indicating a unique activity not observed in other anticoccidial drugs. The mode of action of VM-6387 against E. tenella was revealed to be on the first and the second generation schizogony and the gametogony. Furthermore, the study of the development of the resistance using E. tenella revealed that VM-6387 required ten passages for the development of the resistance, which is longer than the period known for arprinocid. These test results show that VM-6387 and VM-6736 possess an anticoccidial efficacy similar to that of arprinocid and the resistance to VM-6387 is less likely to be developed in the field use than to arprinocid. 2. Since pamaquine and primaquine, which themselves are not the derivatives of nucleic acid component, are known to inhibit dihydroorotic acid in the pyrimidine de novo synthesis pathway of malarian parasite, anticoccidial activities of 8-aminoquinolines were studied. Pamaquine and primaquine exhibited a strong anticoccidial activity against E. tenella at 125-250 ppm and 62.5-250 ppm in feed, respectively, and against E. necatrix at 250 ppm and 125 ppm respectively, in feed. Both pamaquine and primaquine, however, were ineffective against E. acervulina, E. maxima. and E. brunetti. Finally, anticoccidial activities of the combination of sulfonamide (sulfadimidine:SDD) and a folic acid antagonist (2,4-diamino-5-(8-dimethylamino-7-methyl-5-quinolylmethyl)pyrimidine:BQP) (9:1) were studied. While the former and the latter compound, when administered alone, were effective against E. tenella at 2000 ppm and 1000 ppm in feed, respetively, minimum effective doses of the combined drug against E. tenella, E. necatrix, E. acervulina, E. brunetti and E. maxima were determined to be 337.5 ppm + 37.5 ppm, 450 ppm + 50 ppm, 225 ppm + 25 ppm, 225 ppm + 25 ppm, 112.5 ppm + 12.5 ppm in feed, respectively. This synergistic effect is considered to be based on the inhibition of folic acid synthesis pathway, which leads to tetrahydrofolic acid synthesis, at two different positions, as has been reported for similar products (sulfaquinoxaline + diaveridine, sulfamonomethoxine + ormetoprim, sulfadimehtoxine + trimethoprim for example), and is ultimately considered to be the deposition of methyl moiety supply. The spectrum shown in this test result resembles that of purine derivatives. Anticoccidial activity of the combination drug of SDD and BQP was thus first disclosed. As previously mentioned, among chicken coccidia, E. tenella and E. necatrix are extremely susceptible to the inhibition of nucleic acid metabolism, particularly of orotic acid metabolism, while E. acervulina, E. maxima and E. brunetti did not so much respond to orotic acid metabolism inhibitors (or those drugs which most indicated such inhibition). 6-AzaU, carboxyemimycin and 8-aminoquinoline could be potent anticoccididal drugs against E. tenella and E. necatrix. Furthermore, based on the finding that five species of coccidia are commonly highly susceptible to uridine metabolism inhibitors (emimycin riboside) could be a potent anticoccidial drug against E. tenella, E. necatrix, E. acervulina E. maxima and E. brunetti. It was also elucidated that uracils (5-FU, emimycin), purines (VM-6387 and VM-6736) and the combinations of folic acid metabolism inhibitors (SDD:BQP=9:1) possess more potent anticoccidial activities against three species of intestinal coccidia (E. acervulina E. maxima and E. brunetti) than against E. tenella, E. necatrix. |
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| 学位名 | ||||||||||
| 学位名 | 博士(獣医学) | |||||||||
| 学位授与機関 | ||||||||||
| 学位授与機関名 | 麻布大学 | |||||||||
| 学位授与年月日 | ||||||||||
| 学位授与年月日 | 1992-04-08 | |||||||||
| 学位授与番号 | ||||||||||
| 学位授与番号 | 乙第310号 | |||||||||
| 著者版フラグ | ||||||||||
| 出版タイプ | AM | |||||||||
| 出版タイプResource | http://purl.org/coar/version/c_ab4af688f83e57aa | |||||||||
