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アイテム
Fusarium sporotrichioides T-2 トキシン産生株に関する研究
https://az.repo.nii.ac.jp/records/3140
https://az.repo.nii.ac.jp/records/31408b1db71e-bbb3-40e0-b86a-c03c26344050
| 名前 / ファイル | ライセンス | アクション |
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diss_dv_kou0071 (10.2 MB)
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| Item type | 学位論文 / Thesis or Dissertation(1) | |||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 公開日 | 2013-01-16 | |||||||||
| タイトル | ||||||||||
| タイトル | Fusarium sporotrichioides T-2 トキシン産生株に関する研究 | |||||||||
| タイトル | ||||||||||
| タイトル | Studies on Fusarium sporotrichioides strains producing T-2 toxin | |||||||||
| 言語 | en | |||||||||
| 言語 | ||||||||||
| 言語 | jpn | |||||||||
| 資源タイプ | ||||||||||
| 資源タイプ | thesis | |||||||||
| 著者 |
深谷, 宣仁
× 深谷, 宣仁
× Fukaya, Nobuhito
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| 抄録 | ||||||||||
| 内容記述タイプ | Abstract | |||||||||
| 内容記述 | trichothecene系マイコトキシンは，Fusarium属を初め，Baccharis，Myrothecium，Stachybotrys，Cephalosporium，Verticimonosporium，TrichotheciumおよびTrichoderma属等の植物病原真菌によって産生される有毒二次代謝産物であり，世界各国の麦・米・トウモロコシなど多くの穀類を汚染して深刻な問題となっている．trichotheceneは1949年にtrichothesin抗真菌性物質として最初に発見され，次いで1961年にBrianらがFusarium equisetiからdiacetoxyscirpenolを植物に対する毒性物質として単離して以来，その産生菌と代謝産物が世界各地で分離・同定され，現在では約200種に及ぶ化合物が確認されている．これらのtrichotheceneの多くは，食品や飼料の自然汚染，たとえばアメリカでのかびトウモロコシ中毒症や旧ソ連での食餌性無白血球症(alimentary toxic aleukia，ATA)，また，日本での赤かび中毒症等の関連事例から単離されてきた．trichotheceneは，人畜に対し悪心・嘔吐・下痢・皮膚粘膜刺激性の他，白血球減少症や再生不良性貧血などの症状を引き起こす．また，病理学的には細胞増殖の盛んな臓器である腸管上皮・骨髄・脾臓・精巣・卵巣などの増殖性組織に対して，細胞破壊および核破壊を引き起こす．これらの毒性発現は真核細胞におけるDNAや蛋白質の生合成阻害によるもので，特に蛋白質の生合成阻害はribosomeとの強い親和性に依存し，この作用はtrichothecene骨格の活性中心とされる12，13-epoxytrichothecene環が重要な役割を果たすものと考えられている． trichotheceneは化学的には酸素原子を含むsesquiterpeneであり，その生合成経路に関しては多くの研究がなされている．酢酸から生じるメバロン酸を前駆体としイソプレン則に従って生合成されるが，その過程に酸素添加反応やメチル基および水素の転移反応が含まれることが様々な中間体の同定より明らかになった．今日までtrichothecene生合成に関与する酵素としては，HohnらによりF. sporotrichioidesから分離されたtrichodiene synthaseのみである．今なお，trichothecene系マイコトキシンによる人および家畜への汚染は確実に存在する．この現状において，trichotheceneの中でも最も強い細胞毒性を示すT-2トキシンの生合成とその調節に関連する蛋白質の究明は極めて重要であると考え本研究に着手した． 本論文では，T-2トキシンの高い産生能を有するFusarium sporotrichioides M-1-1株を用いたアスパラギン添加実験を発端とし，二次元電気泳動法を導入することによってF. sporotrichioides M-1-1株の菌体蛋白質を分離して数種の蛋白質についてアミノ酸配列分析し，Fusarium属菌で初めての菌体蛋白質の存在およびそのN-末端アミノ酸部分配列を明らかにした．また，この結果からtrichogiene synthaseに続く新たなtrichothecene生合成過程に関連すると推察された数種の蛋白質について，いくつかの興味ある結果を得たのでその概要について報告する． 1． アスパラギン添加によるF. sporotrichioides(M-1-1株とR2301株)のtrichothecene産生性の変動 F. sporotrichioides M-1-1株およびR2301株を用いて，アスパラギンの3濃度(0.01%，0.03%，0.05%)におけるT-2トキシン(T-2)，diacetoxyscirpenol(DAS)およびneosolaniol(NS)(μg/ml)の産生効果を観察した． M-1-1株におけるT-2，DAS，NSのアスパラギン添加による産生性の上昇は，trichothecene産生がアスパラギン添加濃度に比例して上昇した(P<0.05)．一方，R2301株では，アスパラギン添加によるtrichothecene産生性の上昇は若干見られたものの，アスパラギンの添加濃度によるtrichothecene産生性の大きな差異は見られなかった． 2． アスパラギン添加によるF. sporotrichioides M-1-1株の菌体発育と菌体蛋白質量の変動 アスパラギン添加(0.05%)によるM-1-1株の菌体発育と菌体蛋白質量の影響を，培養2日目から7日目まで経時的に測定した． 菌体重量はアスパラギンを添加した翌日(培養3日目)から増加傾向を示し，4日目にわずかに増加したあと急速に減少傾向を示したが，7日間培養では菌体重量の増加を示した(P<0.05)． 菌体蛋白質量はアスパラギンの添加・無添加にかかわらず測定開始の培養2日目から7日目まで一様に減少傾向を示しが，総体的にはアスパラギン添加培養菌体の蛋白質量は無添加と比べ上回っていた(P<0.05)． 3． F. sporotrichioides M-1-1株菌体蛋白質の電気泳動とN-末端アミノ酸配列分析 trichothecene産生性の高いF. sporotrichioidesM-1-1株を選び，菌体蛋白質の解析を電気泳動により行った．二次元電気泳動によっておよそ1,244スポットのFusarium蛋白質が検出された．そのうち，25種類のFusarium蛋白質についてN-末端アミノ酸配列分析を行った結果，13種類のFusarium蛋白質を明かにした． スポット7と13および21のN-末端アミノ酸部分配列は，それぞれSaccharomyces cerevisiae(S. cerevisiae)のmalate dehydrogenanase，Trichoderma koningiiのglyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenaseおよびSchizosaccharomyces pombe(S. pombe)のtriose-phosphate isomeraseのアミノ酸配列にいずれも100%一致した．スポット1はEmericella nidulansのリボソームS16蛋白質に83.3%の相同性を示した．スポット23はS. cerevisiaeのphosphopyruvate hydrataseに72.7%の相同性を示した．スポット3と9はS．pombeのalcohol dehydrogenaseとNeuro-spora crassa(N. crassa)のpeptidyl-prolyl cis-trans isomeraseにそれぞれ66.7%の相同性を示した．スポット12は，スポット9と同じシークエンスを示すが，スポット9より等電点が0.6ほど酸性側にあった．スポット2はChlamydomonas reinhardtiiのリボゾームS12蛋白質に60%の相同性を示した．スポット5はCoccidioides immitisのserine proteinaseに58.3%の相同性を示した．スポット14はMytilus edulisのミトコンドリアのNADH dehydrogenase chain5に55.6%の相同性を示した．スポット19はHyoscyamus nigerのhyoscyamine(6β)-dioxygenaseに46.7%の相同性を示した．スポット6はArachins hypogaeaのarachin25K proteinに若干(36.8%)の相同性を示した． 12個のスポット(4，8，10，11，15，16，17，18，20，22，24，25)蛋白質はそのN-末端がブロックされていた． 4． F. sporotrichioides M-1-1株菌体蛋白質におけるN-末端ブロックアミノ酸の無水ヒドラジン分解およびアミノ酸配列分析 F. sporotrichioides M-1-1株の菌体蛋白質におけるN-末端アミノ酸配列分析の結果，そのN-末端がブロックされていた12スポット(4，8，10，11，15，16，17，18，20，22，24，25)について，各N-末端の無水ヒドラジン分解を行った．無水ヒドラジン分解の施された全ての蛋白質は，バルスリキッド型シークエンサーによって再びアミノ酸配列分析を試みた．その結果，スポット4，8，10，11，16，17，18，20，22，24，25の11種蛋白質におけるN-末端のブロックは除去されなかったが，スポット15はN-末端から15残基まで解読した．そのアミノ酸配列はQTVSXMRLXXXVXDN/であった．このアミノ酸配列に対して，PIR蛋白質のデータベースによる相同性検索を実施したが，これらの情報からは検索できなかった． 5． アスパラギン添加における2種蛋白質の変動 F. sporotrichioides M-1-1株菌体蛋白質の二次元電気泳動において，アスパラギン添加により明らかに変動を認めた2つの蛋白質スポットのうち，等電点7.0，19.7kDaの蛋白質は，peptidyl-prolyl cis-trans isomerase(PPIase)であることがわかった．変動を認めた第2の蛋白質スポット，等電点6.2，42.6kDaの蛋白質は，glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(GPDase)であることがわかった． アスパラギンの添加により変動を認めたPPIaseは，更に，o-phthaldialdehyde(OPA)反応処理によるアミノ酸配列分析によって，41ステップまでのアミノ酸配列が明らかになった． また，M-1-1株の菌糸体から抽出した細胞抽出上清を用い，プロリンペプチド結合のcis-trans異性化に触媒作用をおよぼす能力についてPPIaseの酵素活性を測定した．キモトリプシン添加後，0分，1分，2分，3分目に経時的に分光光度計にて360nmの波長で測定したところ，1分目から活性を示し最終測定である3分目までその活性は持続した．また，その活性は，アスパラギンを添加した3日間および4日間培養において高い活性を示した(P<0.05)． アスパラギン添加における2種蛋白質の変動は，アスパラギン無添加の培養2日目から4日目(以下control-2，3，4と略す)とアスパラギンを添加した培養3日目から4日目(以下N-3，4と略す)までの二次元電気泳動ゲル上での変動を，Molecular Dynamics社のレーザースキャナーを用いてPDQUEST^TM softwareにより解析し，そのOD値を基に分析を試みた．OD値は，できるだけ誤差を少なくするために，比較しあう2つのゲル中でアスパラギンの添加によって誘導されない5つのinternal standard(内部標準蛋白質)を決め，それらの増減の相対値の平均から増減の相対値を算出した． PPIaseの変動は，control-2からcontrol-3における増減の相対値は0.31で僅かに減少傾向を示したもののほとんど変化は見られなかった．control-2からN-3における相対値は1.17で増加傾向を示した．N-3からN-4における相対値が0.41で僅かに減少傾向を示したがほとんど変化は見られなかった．また，control-3とN-3では3.15でN-3はcontrol-3に比べ増加傾向を示した．control-4とN-4では3.49でN-4はcontrol-4に比べ増加傾向を示した． GPDaseの変動は，control-2からcontrol-3における増減の相対値は52.67で増加傾向を示した．control-2からN-3における相対値は57.25で，増加傾向を示した．N-3からN-4における相対値は0.83で僅かに減少傾向を示したがほとんど変化は見られなかった．また，control-3とN-3では0.92でN-3はcontrol-3と比べ，僅かに減少傾向を示したがほとんど変化は見られなかった．control-4とN-4では15.00でN-4はcontrol-4に比べ増加傾向を示した． 本研究は，T-2トキシンの高い産生能を有するFusarium sporotrichioides M-1-1株を用いたアスパラギン添加実験を発端とし，二次元電気泳動法を導入して行われた．前述の実験結果より，M-1-1株培養におけるアスパラギンの添加は菌体蛋白質の合成を亢進して菌体発育の活性化を促進し，trichothecene生合成に関連する酵素あるいは蛋白質の誘導によるtrichothecenes(T-2，DAS，NS)産生の上昇へと一貫した関連性を引き起こしている． F. sporotrichioides M-1-1株菌体蛋白質における初の二次元電気泳動法の導入から，およそ1,244種のF. sporotrichioides M-1-1株細胞質蛋白質の存在が証明された．また，25種類のFusarium蛋白質についてアミノ酸配列分析を行った結果，Fusarium属菌にとって初めての報告になる細胞質蛋白質13種類が確認され，それぞれのN-末端アミノ酸部分配列を決定することができた．その中でも，Hyoscyamus nigerのhyoscyamine(6β)-dioxygenase(H6H)と46.7%の相同性を示したFusarium蛋白質はtrichothecene骨格の活性中心とされる12，13-epoxy trichothecene環の形成初期反応におけるepoxide体形成前段階の水酸化反応に関連している可能性を提示している． また，アスパラギンの添加により明らかに上昇の認められた2つの蛋白質の1つが，F. sporotrichioidesでは初めての報告となる，2種類のpeptidyl-prolyl cis-trans isomerase a (PPIase a)(等電点7.0，19.7kDa)およびpeptidyl-prolyl cis-trans isomerase b (PPIase b)(等電点6.4，19.7kDa)であることを明らかにし，PPIase aはマイナータイプのものであることがわかった．そして，M-1-1株におけるN-末端から41残基までのアミノ酸配列はFusarium属におけるPPIaseのアミノ酸部分配列としても初めての報告であり，Fusarium属菌におけるPPIaseの存在から，菌体発育における生命活動の支配はcyclosporin Aとの化学的相互作用の介在によって調節されている可能性が期待された．上昇を認めた2つ目の蛋白質はglyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(GPDase)であることがFusarium属で初めて明らかにされ，M-1-1株におけるN-末端から24残基までのアミノ酸配列もFusarium属におけるGPDaseのアミノ酸部分配列として初めての報告であった．これら，アスパラギン添加におけるPPIaseとGPDaseの上昇は，菌体産生量の増加およびT-2トキシン産生性の上昇と一貫した関連性が伺われ，GPDaseが，trichothecene生合成の発端であるメバロン酸の合成過程における開始原料の増加誘発に関連している可能性からも，ここにtrichothecene生合成に関与する蛋白質として，新たに3種類(H6H，PPIase，GPDase)の存在が確認された．これらの知見は，T-2トキシン生合成のメカニズムを研究する上で有効な手がかりになるばかりでなく，今後，T-2トキシン産生に関与する酵素系の発現を支配する遺伝子群の特定とその存在様式を明らかにする上で大変有用であり，T-2トキシン産生を支配する遺伝子群が特定できれば，他の多くの有毒真菌株についても類似手法での解析が可能となり，家畜・家禽におけるマイコトキシン中毒症の診断・予防対箪に役立つことであろう． |
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| Abstract | ||||||||||
| 内容記述タイプ | Other | |||||||||
| 内容記述 | Trichothecene mycotoxins, poisonous secondary metabolites, are produced by plant pathogenic fungi, Baccharis, Myrothecium, Stachybotrys, Cephalosporium, Verticimonosporium, Trichothecium and Trichoderma, in addition to Fusarium. Contaminations of many cereals such as wheat, corn and rice are due to the trichothecenes, causing serious world-wide problems. The trichothecenes were found at first as trichothesin, an antifungal agent, in 1949. Since Brian isolated DAS (diacetoxyscirpenol) of Fusarium equiseti as toxic substance for plants in 1961,the toxin-producing fungi and the metabolites has been isolated and identified. The confirmed derivatives have amounted to as many as two hundred types. Many of these trichothecenes has been isolated from natural contamination. These were moldy corn toxicosis in U.S.A., alimentary toxic aleukia in the former Soviet Union and Fusarium toxicosis in Japan. Trichothecenes induce symptoms such as nausea, vomit, diarrhea, mucocutaneous stimulation, leukopenia and aplastic anemia in human and animals. They also induce cytolysis and nuclear destruction in hyperplastic tissue like intestinal epithelium, bone marrow, spleen, testis and ovarium. These toxicities cause inhibition of DNA and proteins syntheses in eucaryocytes. For This effect, it has been considered that the 12, 13-epoxytrichothecene ring on the skeleton of trichothecenes may play an important role. The inhibition of protein synthesis is likely to be a result of it's high affinity for ribosome. Trichothecene is a sesquiterpen containing oxygen atoms and is well studied. Trichothecenes are synthesized following the isoprene rule. It was proven by identification of various intermediates. There are some oxygenation and transfer reactions of the methyl group and hydrogen. So far, the only isolated enzyme that regulates T-2 toxin is trichodiene synthase from F. sporotricoides. The trichothecene mycotoxicosis is still wide-spread all over the world. It is quite important to investigate proteins in volved in the biosynthesis of T-2 toxin. In this dissertation, I will show several N-terminal partial amino acid sequences of novel proteins from Fusarium genus in cluding the key enzyme for synthesis of T-2 toxin. 1. Effects of addition of asparagine to the culture medium on the productions of trichothecenes by F. sporotrichioides (strain M-1-1 and strain R2301). Effects of three different concentrations (0.01%, 0.03%, 0.05%) in the medium on the production of T-2 toxin (T-2), diacetoxyscirpenol (DAS) and neosolaniol (NS) were examined for strains M-1-1 and strain R2301 of F. sporotrichioides. Whereas the production of T-2, DAS and NS of strain M-1-1 was increased in proportion to asparagine concentration (P< 0.05), in strain R2301, increase of trichothecenes productions were minimal and any stoichiometric relationship between trichothecenes productions and asparagine concentrations were not observed. 2. Effect of asparagine on the fungal growth and fungal protein quantity in strain M-1-1 of F. sporotrichioides. Effect of asparagine addition on the fungal growth and fungal protein quantity in strain M-1-1 was measured from day two to day seven. Fungal weight increased from the next day after the addition of asparagine (P<0.05). The amount of fungal protein increased in seven-day culture with asparagine. 3. Electrophoresis of the fungal proteins and analyses of their N-terminal amino acid sequences for strain M-1-1 of F. sporotrichioides One thousand two-hundred forty-four spots of Fusarium proteins were detected by two-dimensional electrophoresis and 13 spots of them were identified by their partial amino-terminal sequences. The partial sequences of the spots 7, 13 and spot 21 show the complete amino acid sequence homologies with those of malaic dehydrogenase of Saccharomyces cecerevisiae, the glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase of Trichoderma koningii and triose-phosphate isomerase of Schizosaccharomyces pombe, respectively. The sequences of the spot 1 showed 83.3% sequence homology with the ribosomal S16 protein of Emericella ninidulans. The homology of the spot 23 with that of phosphopyruvate hydratase of Saccharomyces cerevisiae were 72.7%. The sequences of the spot 3 and spot 9 showed 66.7% homology with alcohol dehydrogenase from S. pombe and the peptidyl-prolyl isomerase from N. crassa, respectively. The sequence of the spot 12 showed the identical sequence as that of spot the 9 but showed a different pI. The spot 2 had 60% sequence homology as compered with that of the ribosomal protein S12 from Chlamydomonas reinhardtii. The sequence of the spot 5 showed 58.3% homology with that of serine proteinase from Coccidioides immitis. The spot 12 shared 55.6% homology with NADH dehydrogenase chain five from mitochondrion of Mytilus edulis. The sequence of the spot 19 showed 46.7% homology with that of hyoscyamine (6β)-hydroxylase from Hyoscyamus niger. The spot 6 showed a slight homology (36.8%) with arachin 25K protein of Arachins hypogaea. Twelve peptides had been blocked at their amino termini. 4. Decomposition by anhydrous hydrazine of N-terminal blocked amino acids and amino acid sequencing of the blocked proteins of strain M-1-1 of F. sporotrichioides fungal protein Among anhydrous hydrazine decomposition and amino acid sequencing of proteins of twelve blocked at N-terminal, the protein spot 15 was blocked by pyrrolidone carboxylic acid group, and the amino terminal 15 residues were determined. The N-terminal amino acid sequence was Glu-Thr-Val-Ser-X-Met-Arg-Leu-X-X-X-Val-X-Asp-Asn. 5. Changes of biosynthesis of two protein species caused by the asparagine addition Of the two-dimensional electrophoresis of proteins from strain M-1-1 of F. sporotrichioides, two species of proteins, spot 9 (7.0, 19.7kDa) showed recognizable increases by asparagine addition and the N-terminal amino acid sequence of one of them (spot 9) was determined up to the 41 step (the number 41 residue) by o-phthalaldialdehede (OPA) reaction. As a result, the spot was identified as a component of peptidyl-prolyl cis-trans isomerase (PPIase). The protein of spot 13 (6.2, 42.6kDa) was sequenced to the 24th residue, and this sequences was searched for their amino acid sequence homology by using PIR-international protein sequence database. The result revealed that this protein was glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GPDase). PPIase activity was the highest at the day three and four of asparagine-added incubation periods, with the strongest relation being observed between fungal weight and T-2 production. I think GPDase might be an inducer of the mevalonic acid in the course of trichothecene synthesis. This study, stanting from the asparagine addition experiment using strain M-1-1 of F. spororichioides which lead to an active production of T-2 toxin, was put into operation by introducing two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis. The results of preceding examination showed that asparagine addition on Strain M-1-1 augumented production of fungal protein and promoted fungal growth, and thus resulted in an increase of trichothecenes (T-2, DAS, NS) production. This study also showed that the enhanced protein synthesis activity induced enzymes and proteins involved in the biosynthesis of trichothecenes. Existence of cellular proteins of approximately 1,244 species in strain M-1-1 of F. sporotrichioides have been proved by introducing two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis for the first time for the genus Fusarium proteins. Fusarium proteins of 25 species were subjected to amino-terminal sequencing, and amino terminal partial sequences of cellular proteins of 13 species were newly determined. The Fusarium protein showing 46.7% homology with hyoscyamine (6β)-hydroxylase (H6H) from Hyoscyamus niger suggests a possibility that it is related to the formation of the early phase of 12, 13-epoxy-trichothecene ring of active center on trichothecenes skeleton. One protein in the two species of proteins which was recognizably increased by asparagine addition was identified as PPIase a (7.0, 19.7kDa) and PPIase b (6.4, 19.7kDa) and was the first proteins for F. sporotrichioides, with the finding that PPIase a was minor type. Also, amino acid sequences from the N-terminal to 41th residue for strain M-1-1 were the first reports of partial amino acid sequences of PPIase of the genus Fusarium. On the basis of existence of PPIase in Fusarium, I think that the growth of fungal plant body is regulated through the chemical interaction between PPIase and cyclosporin A. It was shown for the first time for the genus Fusarium that the second protein found to increase was glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GPDase). Its amino acid sequence from N-terminal to the 24th residue for strain M-1-1 was the first report as partial amino acid sequences of GPDase of Fusarium. These increases of PPIase and GPDase by asparagine addition are proportionally related to the increase in fungal production T-2. It is likely that GPDase activity is a starting material in biosynthsis of mevalonic acid pathway at the early phase of trichothecene biosynthsis, thus the three new proteins (H6H, PPIase, GPDase) were indicated to be related to trichothecene biosynthsis. These observations are not only effectual clues for studying the mechanisms of T-2 biosynthsis,in the future, but also are very useful for searching specific genes that regulate the expression of the enzyme system that are involved in T-2 production and its chemical and biological nature. If we can identify the specific genes controlling T-2 production, it will become possible to analyze, by using similar method, for the many other poisonous fungal species and strains. It will also be useful for diagnosis and prevention of mycotoxicosis of domestic animals and fowls. |
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| 学位名 | ||||||||||
| 学位名 | 博士(獣医学) | |||||||||
| 学位授与機関 | ||||||||||
| 学位授与機関名 | 麻布大学 | |||||||||
| 学位授与年月日 | ||||||||||
| 学位授与年月日 | 1995-03-20 | |||||||||
| 学位授与番号 | ||||||||||
| 学位授与番号 | 甲第 71号 | |||||||||
| 著者版フラグ | ||||||||||
| 出版タイプ | AM | |||||||||
| 出版タイプResource | http://purl.org/coar/version/c_ab4af688f83e57aa | |||||||||
