アカネ色素のラット腎臓における部位特異的な発癌性の機序

満元, 達也

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アカネ色素のラット腎臓における部位特異的な発癌性の機序

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Item type

学位論文 / Thesis or Dissertation(1)

公開日

2025-07-31

タイトル

アカネ色素のラット腎臓における部位特異的な発癌性の機序

言語

タイトル

Mechanisms of site-specific tumorigenesis in the rat kidney treated with madder color

言語

jpn

資源タイプ

doctoral thesis

アクセス権

open access

アクセス権URI

http://purl.org/coar/access_right/c_abf2

著者

満元, 達也

抄録

内容記述タイプ

Abstract

内容記述

第1章　緒言
アカネ色素（MC）はアカネ科セイヨウアカネ（Rubia tinctorum L.）の根から抽出された赤紫色を呈する着色料であり、ハム、ソーセージ等の畜肉加工品、かまぼこ等の水産加工品、菓子類、清涼飲料水、麺類及びジャムなどの着色に使用されていた。しかし、F344ラットを用いた2年間がん原性試験においてMCは腎臓及び肝臓に強力な発癌性を有することが明らかとなった。当試験における腫瘍の発生率は腎細胞腺腫/がんでは雄50匹中43匹、雌50匹中13匹、肝細胞腺腫/がんでは雄50匹中11匹、雌50匹中6匹であり、腎臓が主要な発癌標的臓器であることが示唆されている。興味深いことにすべての腎腫瘍及び前腫瘍性病変は、腎臓の髄質外層外帯（OSOM）に認められた。MCのOSOM部位特異的な腎発癌性は、発がん原因成分と考えられているアントラキノン成分の腎臓における分布と関連している可能性があるが、アントラキノン化合物の腎臓における分布、部位特異性を評価した研究はこれまでに報告されていなかった。そこで本研究では、MCのラット腎臓におけるOSOM部位特異的な発癌性の発生機序を解明することを目的とした。まず第2章では、MCのOSOM部位特異的腎発癌におけるMCの成分と代謝物の役割を明らかにするためラットの腎臓におけるアントラキノン類の分布を脱離エレクトロスプレーイオン化四重極飛行時間型質量分析イメージング（DESI-Q-TOF/MSI）を用いて可視化した。次に第3章では、MCのOSOM部位特異的腎発癌におけるルビアジン（Rub）の役割を明らかにするため、DESI-Q-TOF/MSI解析を用いて、Rubを28日間投与したgpt deltaラットの腎臓におけるRub及びその代謝物の分布を検索することに加え、腎臓の部位特異的な病理組織学的解析及びレポーター遺伝子変異アッセイを実施した。

第2章　脱離エレクトロスプレーイオン化四重極飛行時間型質量分析イメージングを用いたアカネ色素に由来するアントラキノン類の分布の可視化
MCの単回投与1時間後のラット血清について液体クロマトグラフィー-四重極飛行時間型/質量分析（LC-Q-TOF/MS）及びタンデムMS（MS/MS）で解析し、文献値をもとに、アリザリン、ルシジン、ムンジスチン、ノルダムナカンタール、プルプリン、プソイドプルプリン、Rub及びその代謝物を検出、同定した。次に、これら成分をDESI-Q-TOF/MSI分析の対象として腎臓におけるMC成分中のアントラキノン類の分布を経時的に可視化した。その結果、MC投与後のラットの腎臓から検出されたアントラキノン成分のイオン画像は、化学構造に応じた特徴的な分布を示した。まず、1,3-ジヒドロキシアントラキノンのC-2位にヒドロキシメチル基、メチル基及びアルデヒド基を持つルシジン、Rub及びノルダムナカンタールはOSOMでのみ検出された。次にアントラキノン構造のC環にヒドロキシル基のみを持つアリザリン及びムンジスチンは、皮質よりもOSOMで高頻度に検出された。最後に、アントラキノン構造のC-2位がカルボキシル基で置換されているプソイドプルプリン及びプルプリンは、皮質とOSOMで同等に検出された。
アントラキノン成分のうち、変異原性が知られているルシジン及びRubはMCの発癌標的であるOSOMに特異的に分布していたことから、これら2つのアントラキノンがDNA付加体の形成を介してOSOMへの遺伝子突然変異を誘発し、MCのOSOM部位特異的腎発癌に直接関与している可能性が示唆された。また、アリザリン及びプルプリンもOSOMに分布していたことから、これら2つのアントラキノンはその発癌プロモーション作用あるいはエピジェネティック変異原物質としての作用など間接的なメカニズムを通じてMCのOSOM部位特異的腎発癌に重要な役割を果たしている可能性が示唆された。

第3章　ルビアジンの腎臓における局在と病理組織学的変化が示す部位特異的な遺伝毒性
Rubをgpt deltaラットに28日間反復投与した後に摘出した腎臓をDESI-Q-TOF/MSIにより解析した結果、Rub、ルビアジン-硫酸抱合体及びルシジンがOSOM特異的に検出された。ルシジンは変異原性を持つRubの中間体代謝物として知られていることから、OSOMに局在することで、部位特異的な遺伝毒性が生じた可能性が示唆された。Rub及びその代謝物であるルシジンの局在部位と一致して、病理組織学的検査では、Rub高用量群において、OSOMの近位尿細管上皮細胞にカリオメガリー及び微小小胞の空胞変性が認められた。同群の免疫組織化学検査では、二重鎖切断のマーカーであるγ-H2AX及び細胞周期阻害に寄与するp21の陽性細胞も皮質よりもOSOMに高頻度に検出された。γ-H2AX陽性細胞が増加したことによりRubがOSOM特異的なDNA損傷を引き起こしたことが示唆された。p21の陽性細胞はカリオメガリーを伴っていたことから、カリオメガリーの形成には細胞周期阻害が寄与する可能性が示唆された。gpt アッセイでは変異体頻度（MF）は、髄質、皮質いずれの部位も、対照群と比較して全てのRub投与群で用量依存的に増加したが、髄質におけるgpt MFは皮質より明らかに高かった。さらにスペクトラム解析の結果、A:T-T:A transversionのMFの増加が最も特徴的であった。Spi-アッセイではred/gam MFが髄質、皮質いずれの部位も、対照群と比較して全てのRub投与群で用量依存的に増加したが、髄質におけるgpt MFは皮質より明らかに高かった。さらにred/gam変異体のスペクトラム解析の結果、red/gam MFの増加には、欠失、置換等の一塩基変異が大きく寄与しており、大型の欠失変異を引き起こさないことが示された。gptアッセイ及びSpi-アッセイで認められた皮質におけるMFの増加は皮質成分による髄放線によるものと考えられた。

第4章　総括
MCのラット腎臓におけるOSOM部位特異的な発癌性の機序解明を目的として、MCの分布解析を実施した。続いて発癌の直接的な原因と考えられるRubの役割を検索するため分布解析、病理組織学的解析及び変異原性解析を実施した。
MC成分の腎臓における分布解析では、MC成分及びその代謝物の3つの特徴的な分布パターンを示したことで、OSOM部位特異的腎発癌性を有するMCの代謝及び分布の解明に大きく寄与した。MC成分及び代謝物の一部は発癌標的部位であるOSOMに分布しており、直接又は間接的な発癌への寄与が示唆された。今回の可視化技術によって、複数のアントラキノン化合物及びその代謝物が、MCの発癌標的部位であるOSOMに分布し、直接的あるいは間接的なメカニズムで複合的にMCのOSOM部位特異的腎発癌に寄与している全体像が初めて明らかになった。
Rubの反復投与後の腎臓における解析において、RubのOSOM特異的な変異原性を明らかにした。分布解析では、RubがOSOMに局在していることを明らかにした。さらに、Rubの代謝物であるルシジンもOSOMに検出されたことから、OSOMに局在することで、部位特異的な変異原性が生じた可能性が示唆された。Rub及びその代謝物の局在部位と一致して、病理組織学的検査では、Rub高用量群のOSOMの近位尿細管上皮細胞において、カリオメガリーが認められ、免疫組織化学染色では、γ-H2AX及びp21の陽性細胞がOSOMにおいて認められた。これらの結果から、Rub及びその代謝物のルシジンがOSOMに分布することで、DNA付加体の形成を起点に、DSBのような重度のDNA損傷及びDNA損傷応答を介したカリオメガリーを引き起こし、同部位の発癌にも関与していることが示唆された。本結果は、カリオメガリーのDNA損傷及び細胞周期異常による機序を強く裏付けるものであり、カリオメガリー研究の新たなモデル化合物としてのRubの有用性を示すものであった。gpt アッセイでは、髄質におけるgpt MFの増加が明らかとなり、ルシジン由来のDNA付加体が原因と考えられるA:T-T:A transversionが特徴的であったことから、Rub由来のDNA付加体に加えて代謝物のルシジン由来のDNA付加体もRubの変異原性に寄与していることが示唆された。Spi-アッセイではred/gam MFが髄質で増加しており、red/gam変異体のスペクトラム解析から、Rubは一塩基変異によってred/gam MFを増加させたが、大型の欠失変異を引き起こさないことが示された。このように、腎臓を髄質と皮質に切り分けてそれぞれ変異原性を解析する手法によって、RubがOSOM部位特異的な変異原性を有する事を明らかにした。
また、本研究ではRubがOSOMに局在するメカニズムは不明であった。OSOMは近位尿細管のS3領域の集中する部位であり、特にアントラキノン類のような脂溶性の低分子化合物は糸球体から濾過され尿細管へ分泌され蓄積することが想定されるが、アントラキノン骨格を有する化合物を輸送する報告はこれまでにない。Rubと同様に近位尿細管のS3領域に傷害を示す化合物であるオクラトキシンAはアニオン薬物の輸送担体であるOAT1及びOAT3への関与が知られ、いずれも血管側から尿細管の基底膜側にオクラトキシンAを輸送し、S3への障害を引き起こすと考えられている。また、OAT1及びOAT3は本研究で用いた動物種であるラットにおいて、尿細管の基底膜側のS3領域にも発現する報告があり、アントラキノン化合物に類似したステロイド骨格構造を有する化合物を輸送することも知られている。これらのトランスポーターの基質特異性が極めて低いことを踏まえると、Rubが血管側からOAT1及びOAT3を介して尿細管側の基底膜側に取り込まれS3領域に分布し発癌を引き起こす可能性が考えられた。一方で、S3領域に特異的に新たなトランスポーター分子種が見出される可能性もある。今後、アントラキノン類に関わる薬物トランスポーターの基質特異性を明らかにすることで、MCの発癌メカニズムの解明は飛躍的に進むものと考えられる。
本研究では、MC成分であるアントラキノン化合物及びその代謝物の腎臓における組織内分布を可視化し、部位特異的な変異原性解析を組み合わせる新たな手法により、MCのOSOM部位特異的腎発癌の機序解明に大きく寄与した。この研究手法は他の発癌物質による他臓器の発癌機序の解明にも強力なツールとなるものである。

言語

Abstract

内容記述タイプ

Abstract

内容記述

Chapter 1 Introduction
Madder color (MC) has been used in various foods and drinking water for coloring purposes, but a 2-year carcinogenicity study using F344 rats revealed that MC is carcinogenic and toxic specifically to the outer strip of outer medulla (OSOM) of the kidney. The lucidin glycoside (LuP), a component of MC, is metabolized to lucidin and rubiadin (Rub), which show strong mutagenicity, suggesting that genotoxicity of LuP may play an important role in the carcinogenicity of MC. Based on the facts, the OSOM site-specific renal carcinogenicity of MC may be associated with the distribution of LuP or its metabolites in the kidney, however, no studies have evaluated the distributions of these anthraquinone compounds in the kidney. In this study, we aimed to clarify the mechanism of site-specific carcinogenesis of MC in the rat kidney. First, in Chapter 2, we visualized the distribution of anthraquinones in the rat kidney after a single dose of MC using desorption electrospray ionization quadrupole time-of-flight mass spectrometry imaging (DESI-Q-TOF/MSI). Then, in Chapter 3, we examined the distribution of Rub and its metabolites in the kidneys of gpt delta rats treated with Rub, a metabolite of LuP, for 28 days, along with histopathological analysis of the kidneys, immunohistochemical staining, and reporter gene mutation assays to search for a role for Rub in MC renal carcinogenesis.

Chapter 2 Visualization of the distribution of anthraquinone components from madder roots in rat kidneys by desorption electrospray ionization-time-of-flight mass spectrometry imaging（DESI-Q-TOF/MSI）
Liquid chromatography-quadrupole time-of-flight/mass spectrometry (LC-Q-TOF/MS) and tandem mass (MS/MS) analysis of rat serum 1 h after a single dose of MC revealed the detection and identification of alizarin, lucidin, munjistin, nordamnacanthal, purpurin, pseudopurpurin, Rub and its metabolites. These components were subjected to DESI-Q-TOF/MSI analysis to visualize the distribution of anthraquinones in MC components in the kidney over time. Ion images of anthraquinone components detected in the kidneys of rats after MC administration showed a characteristic distribution according to their chemical structure.
Among the anthraquinone components, lucidin and Rub, which were known to be mutagenic, were specifically distributed in the OSOM, a carcinogenic target site of MC, suggesting that these two anthraquinones induces gene mutation to the OSOM via formation of DNA adducts and may be directly involved in the OSOM site-specific renal carcinogenesis of MC. Alizarin and purpurin were also distributed in the OSOM, suggesting that these two anthraquinones may play an important role in the OSOM site-specific renal carcinogenesis of MC through indirect mechanisms such as their carcinogenic promotional actions or actions as epigenetic mutagens.
The results of quantification of anthraquinone compounds by LC-ESI/MS/MS analysis indicated that DESI-Q-TOF/MSI analysis can detect anthraquinones on tissue sections with high sensitivity at concentrations of at least several tens ppb.

Chapter 3 Site-specific genotoxicity of Rub: localization and histopathological changes in the kidneys of rats
DESI-Q-TOF/MSI analysis revealed that Rub localized to the OSOM even after repeated administration of Rub. In addition, Rub-sulfate conjugate and lucidin were also detected in the OSOM. Since lucidin is a genotoxic intermediate metabolite of Rub, its localization to the OSOM may be responsible for site-specific genotoxicity.
Consistent with the localization site of Rub and its metabolites, lucidin, histopathological examination revealed that karyomegaly and vacuolar degeneration of microvesicles were observed in the proximal tubular epithelial cells of the OSOM in the Rub high dose group. In addition, γ-H2AX, double strand brake marker, and p21, which contributed to cell cycle arrest, positive cells were also detected immunohistochemically in the OSOM rather than in the cortex.
The gpt mutant frequencies (MF) increased in a dose-dependent manner in all Rub groups compared to the controls in both the medulla and cortex, but the gpt MF in the medulla was clearly higher than that in the cortex. Spectrum analysis revealed a characteristic MF of A:T-T:A transversion, which was consistent with the mutational pattern of MC or RuP administration. Spi- assay revealed a medullary specific increase in red/gam MF. The spectrum analysis of red/gam mutants showed that Rub increased red/gam MF by single base mutations but not large deletion.
Considering these results, the distribution of Rub and its metabolites, lucidin, to the OSOM induces site-specific histopathological changes, DNA damage, and gene mutation, which directly contribute to site-specific renal carcinogenesis of MC.

Chapter 4 Summary
To elucidate the mechanism of site-specific carcinogenicity of MC in rat kidney, we examined the distribution of MC components and Rub, a metabolite of MC components, histopathological analysis, and mutagenicity. In the distribution analysis, the ion images of MC components and their metabolites showed a charastaristic distribution according to their chemical structure. The MC components and their metabolites were localized to the OSOM, a carcinogenic target site, suggesting direct or indirect contribution to carcinogenesis.
In the distribution analysis of Rub, Rub and its metabolites were localized to the OSOM in the kidneys of rats treated with Rub for 28 days, suggesting that the distribution of Rub and its metabolite, lucidin, to the OSOM induces site-specific histopathological changes, DNA damage and gene mutation, which directly contribute to site-specific renal carcinogenesis of MC.
In this study, we visualized the tissue distribution of anthraquinone compounds and their metabolites in MC components in the kidney, and combined them with site-specific mutagenicity analysis in a novel approach that greatly contributed to the elucidation of the mechanism of OSOM site-specific renal carcinogenesis of MC. This approach will be a powerful tool for exploring the mechanisms of carcinogenesis by other carcinogens in other organs.

言語

学位名

博士（獣医学）

学位授与機関

学位授与機関識別子Scheme

kakenhi

学位授与機関識別子

32701

学位授与機関名

麻布大学

学位授与年月日

2025-03-07

学位授与番号

乙第448号

Rights

値

本論文は全て以下に公表した。
・Ishii Y., Nakamura K., Mitsumot T., Takimoto N., Namiki M., Takasu S. and Ogawa K. (2022). Visualization of the distribution of anthraquinone components from madder roots in rat kidneys by desorption electrospray ionization-time-of-flight mass spectrometry imaging. Food Chem. Toxicol. 161, 112851. https://doi.org/10.1016/j.fct.2022.112851
・Mitsumoto T., Ishii Y., Takimoto N., Takasu S., Namiki M., Nohmi T., Umemura T. and Ogawa K. (2023). Site-specific genotoxicity of rubiadin: localization and histopathological changes in the kidneys of rats. Arch. Toxicol. 97, 3273–3283. Reproduced with permission from Springer Nature.

著者版フラグ

出版タイプ

VoR

出版タイプResource

http://purl.org/coar/version/c_970fb48d4fbd8a85

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