@misc{oai:az.repo.nii.ac.jp:00005390,
 author = {度会, 晃行},
 month = {2021-03-12, 2020-05-08},
 note = {[General Introduction]
The mother of mammals, including humans, cares their offspring by breast-feeding. The placenta, formed shortly after fertilization, not only provides fresh blood to the offspring from the mother but also synthesizes various hormones during pregnancy, inducing changes necessary for maternal behaviors. The hormones synthesized by the placenta include progesterone, estrogen, prolactin, and oxytocin (OT). These endocrine changes act not only on peripheral tissues such as the uterus and mammary gland but also on contribution on promoting the onset of od maternal behaviors in the
central region. In particular, estrogen, which increases in late pregnancy, plays a central role in the development of nurturing behavior (Siegel and Rosenblatt, 1975; Terkel and Rosenblatt, 1972). Estrogen increases the expression of oxytocin receptors (OTR) (Champagne et al., 2001; Ostrowski et al., 1995). It has been reported that maternal behaviors are induced in mice deficient in the OT and OTR gene (Takayanagi et al., 2005 a, 2005 c) and that the expression level of OTR in the central region correlates with the number of maternal behaviors (Champagne et al., 2001). Thus, the estrogen-driven OT system plays an important role in the development of nurturing behavior. OT-synthesizing neurons in the hypothalamus extend their axons to the various regions in the brain (Knobloch et al., 2012). In the lateral septum and paraventricular thalamic nucleus (PVT) of the mother mouse, the terminals of OT neurons are observed at high densities (Knobloch et al., 2012). OTR-expressing neurons in the lateral septum have been implicated in stress response and have been shown to contribute to maternal tolerance to fear during lactation (Menon et al., 2018). On the other hand, PVT is involved in associated learning (Do-Monte et al., 2015), but there are few previous findings of social behavior and nurturing behavior. In the present study, we investigated how the OTR-expressing neurons 10
in PVT contribute to maternal behavior.
[Capter1: Oxytocin receptor-expressing neurons in the posterior paraventricular thalamic nucleus enhance maternal behavior of dams]
Along the anterior-posterior axis, the pattern of neural input to the rostral aPVT and caudal pPVT is not identical, and some nuclei project more strongly to one side (Li and Kirouac, 2012). Also, aPVT and pPVT have different responses to rewarding stimuli, and pPVT has more neurons that are more responsive to rewarding stimuli (Choi et al., 2019). Therefore, it was considered necessary to separate aPVT and pPVT, which have different anatomical and functional properties, for experimental and analytical studies on PVT. We longitudinally examined the distribution of OTR-expressing neurons in PVT and defined the regions of aPVT and pPVT from the pattern. We provided pups to a dam and quantified the number of activated OTR-expressing neurons in aPVT and pPVT. OTR-expressing neurons in pPVT are predominantly activated by pup exposure. Additionally, when the OT input to pPVT was inhibited by the chronic blockade of OTR, the dams showed a specific decrease in the crouching behavior. These results suggest that OTR-expressing neurons in pPVT are actively involved in crouching behavior.
[Capter2: The activation of oxytocin receptor-expressing neurons in the posterior paraventricular thalamic nucleus reinforces behaviors]
Behavior is induced by a specific sensory stimuli, which are called antecedent stimuli. An increase in the behavioral frequency results from a stimulus or treat accompanying the behavior, which is called reinforcement. An inhibition of OTR, which is involved in processing the antecedent stimuli, results in an immediate reduction in maternal 11 behaviors of mouse dams (Marlin et al., 2015). On the other hand, maternal behaviors are not decreased by a blockade of OTR involved in the reinforcement, but decreases by multiple times block (Pedersen et al., 1995). In Chapter 1, although the acute blockade of OTR in pPVT was ineffective in the reduction of crouching behavior, the chronic blockade reduced that duration. Furthermore, OTR-expressing neurons in PVT were activated by OT (Febo et al., 2005), which suggests that activation of OTR-expressing neurons in pPVT contributes to the reinforcement. Then, we combined optogenetic techniques with conditional place preference test (CPP) to examine whether activation of OTR-expressing neurons in pPVT
contributes to the reinforcement. The relationships between specific neural activity and the reinforcement have been quantified by increasing or decreasing the interesting behavior or have been evaluated as a more sensitive method by CPP (Gul Dolen et al., 2013). In this study, CPP was performed as a conditioned stimulus for activation of OTR-expressing neurons in pPVT. This activation allowed the experimental mice to stay longer in the conditioned area. The result suggests that the activation of neurons expressing OTR in pPVT is involved in the reinforcement. 
[Capter3: In the posterior paraventricular thalamic nucleus, neurons projected from the medial prefrontal cortex inhibit maternal behavior of dams]
From the results of Chapters 1 and 2, it was suggested that crouching behavior is regulated by the reinforcement through the activation of OTR-expressing neurons in pPVT. On the other hand, there are cases in which activation of PVT causes behavioral extinction (Lkhagvasuren et al., 2014; Zhu et al., 2018). These suggest that PVT contains not only neurons that are activated to enhance behavior but also neurons to decrease behavior. In other words, we hypothesized that, in the pPVT of dams in which the maternal behavior was eliminated, the other neurons were enhanced instead of OTR-expressing neurons. We prepared mother mice in which maternal behaviors were decreased due to a stress 12 sensitization (stressed dams). Hereinafter, the mouse is referred to as stressed dams. The pPVT in stressed dams exposed to pups showed no difference in the number of activated neurons, compared with control dams. On the other hand, pup exposure activated mPFC, which is the main input region of pPVT (Li and Kirouac, 2012), in stressed dams than in control dams. Additionally, compared with control dams, stressed dams had an increased proportion of neurons activated by pup exposure in the mPFC neurons projecting to pPVT. Using pharmacogenetic techniques, the chronic activation of mPFC neurons projecting to the pPVT reduced the crouching behavior of dams. These results suggest that neurons projected from the mPFC in the pPVT reduce crouching behavior of dams through the chronic activation.
[General consideration]
To date, studies of the neural mechanisms for the onset of maternal behaviors have been conducted extensively by many researchers, and many findings have been presented (Kohl et al., 2018; Numan and Young, 2015). Dams usually maintain high levels of nurturing behavior, but when significant changes occur in their physiology or environment, they flexibly regulate the amount of maternal behavior (Murgarroyd et al., 2016). Although some neural mechanisms involved in regulating the amount of maternal behavior have been previously reported (Bosch and Neumann, 2008; Figueira et al., 2008; Francis et al., 2002), many aspects of the neural mechanisms remain unclear. The present study showed that the crouching behavior of the mother mice was enhanced by activation of OTR-expressing neurons in the pPVT and abolished by activation of neurons receiving neural projections from the mPFC. It has been shown that an excitability of neurons involved in behavioral reinforcement in PVT are inhibited by punishments, whereas neuronss involved in behavioral extinction are inhibited by reinforcers (Zhu et al., 2018). As with other thalamic regions, PVT contains few inhibitory neurons (Zhu et al., 2016). Moreover, NAc, which receives projections from the PVT, regulates behavioral expression in a 13 learning manner by inhibitory projections and mutually projects to the PVT (Broms et al., 2017). These results suggest that OTR-expressing neurons to receive OT from the PVN and neurons projected from mPFC in pPVT mutually suppresses each other through NAc. The single neural manipulations in pPVT did not affect maternal behavior, but the decreases of
crouching behavior were observed by chronic manipulations in pPVT. PVT has been shown to induce plastic changes and alter a behavioral expression by repeated trials (Zhu et al., 2018). This suggests that the regulation of crouching behavior by pPVT requires plastic changes in the postsynaptic neurons of pPVT projected from the PVN or the mPFC. Taken together, all results obtained through this study suggest that the crouching behavior of mouse dams is regulated to enhance by OT secretion from the PVN and to inhibit by projections from the mPFC. It is also important in the regulation ofcrouching behaviors that plastic changes of the pPVT neurons are induced by repeated activations through each input., この博士論文は内容の要約のみの公開（または一部非公開）になっています, 【総合緒言】 
　その名のごとく、ヒトを含めた哺乳類の母動物は母乳を介して仔を育てる。受精後、間も無く形成される胎盤は、母から仔へ新鮮な血液を供給するだけでなく、様々なホルモン合成を行い、妊娠中の母体に養育に必要な変化を引き起こす。胎盤によって合成されるホルモンはプロゲステロンやエストロゲン、プロラクチン、オキシトシン(OT)などが挙げられる。これらホルモンは子宮や乳腺などの末梢組織に限らず、養育行動を司る中枢領域に作用し、養育に必要な形質を作り上げる。とくに、OTは養育行動の発現に中心的な役割を果たす。OT遺伝子やOTR遺伝子を欠損したマウスでは養育行動の発現は見られず(Takayanagi et al., 2005a, 2005b)、また中枢領域におけるOTRの発現量が養育行動の発現量に相関することが報告されている(Champagne et al., 2001)。
　視床下部におけるOT含有神経細胞は脳内のあらゆる領域にその軸索を伸ばしており、母マウスの外側中隔と視床室傍核(PVT)では高い密度のOT神経細胞の神経終末が観察される(Knobloch et al., 2012)。外側中隔はストレス応答に関わるとされ、そのOTR発現細胞は母マウスの恐怖刺激に対する耐性に寄与することが明らかにされている(Menon et al., 2018)。一方で、PVTは一般学習課題に関与することが示されていたものの(Do-Monte et al., 2015)、社会行動に関する知見は極めて少なく、PVTにおけるOTR発現細胞の機能については未だ明らかにされていない状況であった(Kasahara et al., 2016; Lonstein et al., 1997)。そこで、本研究では、豊富なオキシトシンを受けるPVTと、そのOTR発現細胞が養育行動に対してどのような機能を有するのか調べることとした。

【第1章：視床室傍核-尾側部における養育行動を強化する神経細胞】
　吻尾側に長いPVTでは、吻側側のaPVTと尾側側のpPVTへの神経入力のパターンは同一ではなく、一方に対してより強く投射を行う神経核が存在する(Li and Kirouac, 2012)。また、aPVTとpPVTでは報酬性刺激に対する応答性が異なり、pPVTの方が報酬性刺激に対して反応性の高い細胞が多く存在している(Choi et al., 2019)。したがって、PVTに関する研究を進める上で、異なる解剖学的および機能的性質を持つaPVTとpPVTは分離して、実験および解析を行う必要があると考えられた。
　そこで本研究では、第1章にて、PVTのOTR発現細胞の分布を縦断的に調べ、そのパターンよりaPVTとpPVTとする領域を定義した。次に、仔マウスを提示し、aPVTとpPVTそれぞれにおいて活性化されるOTR発現細胞の数を定量したところ、pPVTにおいてのみ活性化したOTR発現細胞の割合が増加していた。さらに、OTRのアンタゴニストを用いてpPVTへのOT入力を慢性的に阻害したところ、母マウスは母性行動のひとつであるクラウチング行動（仔への覆いかぶさり行動）の特異的な減少を示した。これらの結果は、pPVTにおけるOTR発現細胞が養育行動に対して促進的に関わっていることを示唆している。

【第2章：視床室傍核-尾側部における活性化により強化子となる神経細胞】
　行動の発現は特定の感覚刺激により誘起され、そのような刺激を先行刺激と呼ぶ。また、行動に随伴する刺激によって、その行動頻度が増すことを強化と呼ぶ。先行刺激となる仔マウスからの情報処理に関与するOTRを阻害すると、操作を受けた母マウスは直ちに養育行動を減少させる(Levy et al., 2004)。しかし、行動の強化に関与するOTRは複数回の阻害によってのみ行動の減少を引き起こす(Pedersen et al., 1995)。第1章では、pPVTにおけるOTRの阻害は単回では効果はなく、慢性的な阻害によってのみクラウチング行動の減少が観察された。これらのことから、pPVTにおけるOTRは行動の強化に寄与していると考えられた。また、PVTのOTR発現細胞はOTの受容により活性化することから(Febo et al., 2005)、pPVTにおけるOTRは細胞を活性化させることで行動の強化に寄与していると仮説を立てた。そこで、光遺伝学的手法と場所指向性テスト(CPP, Conditional Place Preference Test)を組み合わせ、その仮説を検証した。具体的には、条件づけ刺激の提示として、pPVTのOTR発現細胞の活性化をもたらす光照射を実験装置内の特定の場所で行なった。これにより、実験マウスは光照射が行われた場所での滞在時間を延長させた。この結果は、pPVTのOTR発現細胞の活性化が行動の強化に寄与することを示唆している。

【第3章：視床室傍核-尾側部における養育行動を消去する神経細胞】
　第1章および第2章の結果から、母マウスのクラウチング行動はpPVTのOTR発現細胞の活性化を通して強化されていると考えられた。しかしながら、PVTは報酬だけでなく、消去を引き起こす罰の曝露によっても活性化され(Zhu et al., 2018)、その活性化が行動の消去をもたらすことが示されている(Lkhagvasuren et al., 2014; Zhu et al., 2018)。これらのことから、PVTには活性化することで、行動の強化をもたらす細胞だけでなく、行動の消去をもたらす細胞が存在すると考えられた。そこで、養育行動が消去されている母マウスのpPVTでは、OTR発現細胞に変わって他の細胞の神経活性が増強され、養育行動の発現が制御されていると仮説を立てた。
　まず、ストレス感作により養育行動の発現量が減少した母マウスを作出した。以下、そのマウスをストレス母マウスと呼称する。仔マウスを提示した際のストレス母マウスのpPVTにおける神経活性を調べると、仔マウスを提示された通常の母マウスと比較しても差は見られなかった。一方、pPVTの主要な入力な領域であるmPFCでは(Li and Kirouac, 2012)、ストレス母マウスは通常の母マウスに比べ仔マウス提示により多くの細胞が活性化していた。そこで、ストレス母マウスのmPFCにおけるpPVTへ投射する神経細胞が活性化される割合を調べた。すると、ストレス母マウスは、通常の母マウスに比べて、仔マウス提示により活性化されるmPFCのpPVTへ投射する神経細胞の割合を増加させていた。さらに、遺伝薬理学的手法を用いて、pPVTへ投射するmPFCの神経細胞を慢性的に活性化させると、母マウスのクラウチング行動は減少した。これらの結果は、pPVTにおけるmPFCからの入力をうける神経細胞が慢性的に活性化されることで、クラウチング行動に対して抑制的に働くことを示唆している。

【総合考察】
　これまで、養育行動の獲得や実行に必要な神経メカニズムに関する研究は、多くの研究者によって広く行われ、多くの知見が示されてきた(Kohl et al., 2018; Numan and Young, 2015)。一般に獲得された母ラットの養育行動の発現量は高く維持されているが、自身の生理的状態や環境に応じて、柔軟にその量が調節される(Murgatroyd et al., 2016)。このような養育量を調節する神経機構については、いくつかの知見が示されているものの(Bosch and Neumann, 2008; Figueira et al., 2008; Francis et al., 2002)、その神経メカニズムについては未だ明らかでない点が多く残っている。本研究は、養育のひとつであるクラウチング行動が、pPVTにおけるOTR発現細胞の活性化により強化され、mPFCからの神経投射を受ける細胞の活性化により消去されることを示唆した。
　PVTにおける強化に関与する細胞は罰の提示によりその活性が抑制され、消去に関わる細胞は報酬により抑制されることが示めされている(Zhu et al., 2018)。また、他の視床領域と同様、PVTの構成する細胞に抑制性細胞はほとんど存在しない(Zhu et al., 2016)。さらに、PVTからの投射を受けるNAcは抑制性伝達により行動発現を学習性に制御しており、PVTへ投射している(Broms et al., 2017)。これらのことから、pPVTはNAcに対して興奮性伝達を行うとともに、NAcから抑制性の負のフィードバックを受けていると考えられた。そして、行動の強化と消去を効率的に行うために、PVNからのOTを受けるOTR発現細胞とmPFCからの神経投射を受ける細胞は、その下流であるNAcを介して、相互に抑制する回路を形成していると考えられた。
　pPVTに対する神経操作は、いずれも行動試験中の単回の操作では影響を与えず、養育期間中の慢性的な操作によってのみ行動の変化を引き起こした。PVTは複数回の試行を繰り返すことで、神経の可塑的な変化を引き起こし、学習した行動の発現量を変化させていることが示されている(Zhu et al., 2018)。また、同研究において、強化された行動の発現量はPVTの単回の神経操作では変化せず、繰り返し神経操作が行われることで影響を受けることが示されている(Zhu et al., 2018)。このことから、pPVTによるクラウチング行動の発現調節には、養育行動を促進するPVNまたは養育行動を抑制するmPFCからpPVTへの投射におけるポストシナプス側であるpPVTの神経細胞の可塑的な変化が必要となると考えられた。
　本研究を通して得られた結果をまとめると、母マウスのクラウチング行動はPVNからのOT分泌とmPFCからの神経投射により、強化または消去が引き起こされ、その発現量が調節されていることを示唆している。また、その強化や消去のプロセスには、それぞれの入力を受けるpPVTの細胞が繰り返し活性化されることで可塑的な変化を起こすことが重要であるといえる。},
 title = {マウスの視床室傍核-尾側部における養育行動の発現量を調節する神経メカニズム},
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