@phdthesis{oai:az.repo.nii.ac.jp:00005305,
 author = {岩下, 直樹},
 month = {2019-03-28, 2019-03-19},
 note = {Periodontal disease, which is defined as a chronic inflammatory disease of the periodontal tissue, is most frequently observed in small companion animals, such as dogs and cats. Approximately 80% of cats reportedly suffer from periodontal disease at 4 years of age, which affects their overall health and wellbeing. Periodontal disease develops when periodontitis-related bacteria form a mature biofilm through coaggregation with endogenous bacteria in dental plaque. Periodontal pathogenic bacteria are able to alter the environment of the periodontal tissue, even when present at low levels. This can induce an abnormal host immune response that may lead to tissue destruction and establishment of periodontitis. Several periodontitis-related bacteria have been isolated from periodontal tissue specimens collected from dogs and cats. Porphyromonas gulae (also known as P. gingivalis resemblance bacteria or P. gingivalis of animal type) is a gram-negative anaerobic bacterium that produces melanotic pigment and has been implicated as one of the key bacterial species involved in the establishment of periodontal disease in many animal species. At present, P. gulae has been isolated from the oral cavities of dogs and cats. Although several investigations have focused on the periodontitis-related bacterial species that have been isolated from cats, the role of specific bacterial genes and proteins in the development of periodontitis in cats has not yet been investigated. The investigation of the pathogenicity of major periodontal pathogenic bacteria in cats is important and will aid the identification of cats with a higher risk of periodontitis. Early dental treatment can then be implemented to these animals as an effective preventive measure.
Halitosis is another common problem encountered in companion animals and can cause significant problems in the relationship between an affected animal and its owner. It is generally attributed to an increase of anaerobic bacteria in the oral cavity. Volatile Sulfur Compounds (VSC) produced by these bacteria are primarily responsible for halitosis. Organoleptic examination is currently the standard assay used to evaluate halitosis; however, it lacks objectivity. Therefore, the development of an alternative halitosis assay, which is both objective and quantitative, is required.

Chapter 1: Identification and molecular characterization of P. gulae fimA types among cat isolates
P. gulae, a gram-negative, black-pigmented, anaerobic bacterium, is one of several major periodontal pathogenic bacteria found in animals. Bacterial fimbrial structures that are formed at the cell surface are composed of FimA, which is a 41-kD a fimbrillin subunit protein. FimA was originally identified in P. gingivalis cloned from a human. Subsequent studies revealed that FimA is also expressed in bacterial isolates from companion animals. For example, P. gulae FimA, which is highly homologous to P. gingivalis FimA, has been identified in bacterial strains isolated from dogs. The FimA from dog P. gulae and human P. gingivalis have been classified into three (types A, B, and C), and six (types I, Ib, II, III, IV, and V) genotypes, respectively. Each genotype appears to be closely related to severity of periodontal disease. P. gulae strains are cytotoxic to human gingival epithelial cells and cause systemic inflammation and toxicity in mice. Studies comparing the relative pathogenic abilities of strains expressing each of the FimA genotypes have suggested that type C P. gulae with are the most virulent. Indeed, type C P. gulae have been detected at high levels in an oral cavity swab specimen taken from a dog with serious periodontal disease. To date, although some studies have focused on the identification of periodontitis-related bacterial species in cats, none have investigated the roles of specific bacterial genes or proteins in this process. Therefore, in Chapter 1, I analyzed FimA diversity and virulence of P. gulae isolated from cats and investigated whether that diversity affects periodontal condition.
P. gulae isolates were identified from samples of tooth plaque collected through oral swabs from the periodontal tissues of cats visiting the animal hospital. The fimA nucleotide sequence was determined from each isolated P. gulae strain, and a phylogenic tree was constructed based on putative FimA amino acid sequences. To evaluate the adhesion and invasion properties of each of the P. gulae isolates, periodontal ligament fibroblasts (HPdLF) were infected with cultures of each P. gulae strain adjusted to a density of 1×107 colony-forming units (CFU). Next, the effect of each strain on cell proliferation and migration was investigated using in vitro cell proliferation and wound healing assays. Finally, to investigate the general distribution of P. gulae fimA genotypes among cats, oral cavity swabs ware taken from cats visiting the animal hospital, and a PCR-based method was used to determine the P. gulae genotype present.
The putative amino acid FimA sequences from 15 P. gulae isolates obtained from 13 cats were classified into three genotypes (types A, B, and C), and showed 95%–100% identity and similarity to P. gulae obtained from dogs. The type C strains exhibited stronger adhesion properties to HPdLF cells and higher invasion rates compared with the type A and type B strains. Furthermore, the wound healing assay revealed that the type C strains significantly inhibited cellular proliferation and the scratch closure of HPdLF cells.
Finally, a PCR-based method for identification of P. gulae fimA genotypes was developed and used to analyze 99 oral swab specimens obtained from cats. The distribution rates of P. gulae type A, B, and C strains were found to be approximately 75%, 30%, and 20%, respectively. A high level of type A strain was detected regardless of the severity of periodontal disease. However, high levels of type B and C strains were detected in cats affected by moderate and severe periodontal disease, respectively.
In summary, three fimA genotype of P. gulae isolates derived from cats were identified and classified. The fimA genes were classified into three genotypes, type A, B, and C. Although the type C isolates were less prevalent than type A and B isolates, they were the most pathogenic for HPdLF. Furthermore, the molecular technique used to classify P. gulae fimA genotypes developed in this study will be useful to predict the risk of periodontitis development in cats.

Chapter 2: Establishment of a simple gas chromatography method as a quantitative measurement method for dog halitosis.
There is halitosis as the clinical manifestations appealed from dog owners. Room breeding rate of dog was more than 80% in this country and a relation of owner and dog became closer. The primary cause of halitosis is considered to be volatile sulfur compounds (VSC), such as hydrogen sulfide, methyl mercaptan, and dimethyl sulfide produced by pathogenic bacteria, which proliferate as periodontitis progresses. In recent years, dental clinics have quantified VSC using gas chromatography- and semiconductor sensor-based measuring instruments and odor sensors. However, a diagnosis of halitosis in dogs generally relies on organoleptic test. Although organoleptic test is easy to perform it lacks objectivity. Therefore, the development of an alternative halitosis assay, which is both objective and quantitative, is required. The present study aimed to assess the association between oral malodor and periodontitis in dogs.
Laboratory Beagle dogs were included in this study. Oral halitosis was evaluated using an organoleptic test score and OralChroma™ to measure the oral levels of the following VSC: hydrogen sulfide (H2S; HS), methyl mercaptan (CH3SH; MM), and dimethyl sulfide (CH3SCH3; DMS)
The frequencies of detected VSC were in the following order: HS > MM > DMS. No significant change was observed in the levels of VSC before and after food intake. In addition, a significantly positive relationship was revealed between oral malodor and periodontitis, both of which are age-dependent in dogs.
In summary, this investigation suggested that aging is an important factor for oral malodor and periodontitis in dogs. Therefore, the quantification of the level of VSC would be a useful method to predict the probability of a companion animal developing periodontitis.

To conclude, the results presented in Chapter 1 showed that P. gulae was the important periodontal pathogenic bacteria common to dogs and cats, and FimA diversity was linked to pathogenicity. It is possible that the identification of the FimA type in a P. gulae strain isolated from oral swabs would be useful to predict the periodontitis risk of a companion animal. The data described in Chapter 2 suggested that VSC present in breath air cause canine malodor, and the level of VSC is closely associated with aging and the development of periodontitis in dogs, 【背景】歯周病はイヌやネコとなどの小型伴侶動物に最もよくみられる感染症であり、歯周組織の慢性炎症疾患として定義される。4歳のイヌおよびネコは約80％が歯周病を発症しており、歯周病は全身の健康や生活状態にも悪影響を及ぼすことが知られている。歯周病は歯垢内に存在する内因性の細菌によって始まり、口腔内細菌の増加を介し、歯周病に関連する病原性細菌が成熟したバイオフィルムを形成することにより発症する。歯周病原性細菌はたとえ少数であっても歯周組織の環境を変え、異常な宿主免疫反応を誘発し、歯周病を進展させる。歯周炎に関連する細菌種がイヌおよびネコから採取された歯周組織検体において検出さている。Porphyromonas gulae （かつてはP. gigivalis類似菌、または、P. gingivalisの動物型、と呼称された）は黒色色素を産生するグラム陰性嫌気性細菌であり、いくつかの他の病原細菌種とともに、多くの動物種において歯周病と関連している。現在までに、P. gulaeはイヌおよびネコの口腔内から検出されている。
ネコから検出された歯周炎に関連する細菌種に着目した研究はいくつか報告されているが、特定の細菌の遺伝子やタンパク質と歯周病との関連については検討されていない。歯周病リスクの高いネコを判別し、可及的速やかに適切な処置を行うには、ネコにおける主要な歯周病原性細菌の病原性を調べることが重要である。
また、伴侶動物と飼主の関係がより密接になったことから、伴侶動物の口臭が問題となっている。一般に口臭は口腔状態の悪化により口腔内の嫌気性細菌が増加した結果、生成される揮発性硫黄化合物（VSC: Volatile Sulfuric Compounds）が主要な原因物質であると考えられている。標準的な口臭測定法である官能試験は、簡易な方法であるものの客観性に乏しい方法でもあるため、客観的かつ定量的な口臭の測定法の確立が期待されている。

第一章：ネコ由来Porphyromonas gulaeのfimAタイプの同定および分子学的特性
グラム陰性、黒色色素産生性、偏性嫌気性細菌であるPorphyromonas gulaeは動物の主要な歯周病原性細菌の一つである。菌体表層に形成される線毛は分子量41kDaの構成タンパク質fimbrillin (またはFimA)で構成され、ヒトから分離されたP. gingivalisにおいてはじめて同定された。小動物では、FimAはイヌから分離されたP. gulaeにおいて見出されており、ヒト由来P. gingivalisのFimAと相同性が高いことが報告されている。ヒト由来P. gingivalisのFimAは 6タイプの遺伝子型(Ⅰ～Ⅴ型およびⅠb型)に、イヌ由来P. gulaeのFimAは3タイプの遺伝子型(A型、B型およびC型)に分類され、これらの遺伝子型は歯周病の重症度と密接に関連している。P. gulaeは歯周上皮細胞に細胞毒性、マウスに全身性炎症を惹起するなど、さまざまな毒性を発現する。3タイプの遺伝子型の比較では、C型のP. gulaeはA型およびB型よりも病原性が強く、重篤な歯周病を有するイヌから採取した口腔スワブ検体から高い割合で検出される。ネコから検出された歯周炎に関連する細菌種に着目した研究はいくつか報告されているが、特定の細菌の遺伝子やタンパク質と歯周病との関連については検討されていない。第一章では、ネコから分離したP. gulaeのFimA多様性および病原性を解析し、この多様性が歯周状態に影響を及ぼすか否かを検討した。
【材料と方法】動物病院に来院したネコの歯周組織から口腔スワブを用いて歯垢を採取した後、P. gulaeを分離、株化した。その後、fimAの塩基配列を決定し、アミノ酸配列に基づいた系統樹を作製した。次に、1×107CFUに調整したP. gulaeを歯根膜線維芽細胞に感染させ、細胞への付着・侵入能を評価した。また、細胞増殖率、細胞遊走能を評価するため、細胞増殖試験およびin vitro創傷治癒試験を実施した。また、一般家庭で飼育されているネコにおける、P. gulaeの亜型の保有率を調査するため、動物病院に来院したネコから口腔スワブを用いて歯垢を採取し、PCR法にて亜型を検出した。
【結果】13匹のネコから分離した15株のP. gulaeが保有するFimAの推定アミノ酸配列は3つの異なる遺伝子タイプ（A型、B型およびC型）に分類されるとともに、イヌから分離したP. gulaeの各3タイプと95～100%の高い相同性を示した。C型分離株はA型およびB型よりも、歯根膜線維芽細胞への高い付着・侵入能を示すとともに細胞の増殖を有意に抑制し、in vitro創傷治癒試験においてひっかき傷による空隙が埋まるのを強く抑制した。次に、本研究はPCR法を基にしたfimA遺伝子型の判別方法を確立し、99匹のネコの口腔スワブ検体を解析した。ネコの口腔スワブ検体において、P. gulaeのA型、B型、C型の分布率は、それぞれ約75%、30%、20%であった。A型は歯周病の重症度に関係なく高い割合で検出されたが、B型は中等度歯周病ネコで、C型は重篤な歯周病ネコで検出率が高かった。
【考察・結論】本章ではネコ由来P. gulaeのfimA遺伝子型を同定・分類した。fimA遺伝子は3タイプに分類でき、そのなかでもC型はA型およびB型よりも検出率が低かったものの、歯周細胞に対して最も強い病原性を示した。本研究で開発された口腔スワブ検体から直接、P. gulaeの fimA遺伝子型を分類する分子生物学的手法は、ネコの歯周病リスクを評価することに有用であると考えられる。

第二章：簡易ガスクロマトグラフを用いたイヌ口臭の定量的測定法の確立
歯周病のイヌの飼い主が訴える臨床症状として口臭がある。イヌの室内飼育率が本邦では80%以上となり、ヒトとイヌの関係がより密接になった。口臭の主な原因は歯周病の進行に伴い増殖した歯周病原性細菌が発生させる硫化水素、メチルメルカプタンおよびジメチルサルファイドなどの揮発性硫黄化合物(VSC)であると考えられている。近年、ヒト歯科医療では半導体センサーを用いた匂いセンサーや簡便な口臭測定器、さらにガスクロマトグラフに基づくVSC測定器が開発されている。しかし、イヌにおいては口臭の診断は官能試験が一般的である。官能試験は簡易的である反面、客観性に乏しい欠点がある。そのため、口臭の原因となる物質を定量的に測定する方法が望まれている。本章は近年、ヒト用に開発された簡易ガスクロマトグラフであるオーラルクロマ®を使用し、イヌの呼気中におけるVSC濃度の測定法を確立し、口臭および歯周病との関連性を調べることを目的とした。
【材料と方法】麻布大学内で飼育されている実験用ビーグル犬を実験に使用した。口臭の測定は官能試験およびオーラルクロマによって行った。官能試験は一人の測定者による判定により口臭スコア（0～3）付けを行った。歯周状態の評価は歯石と歯肉炎の程度によりスコア（0～3）付けを行った。呼気中に含まれる3種のVSC（硫化水素、メチルメルカプタンおよび硫化ジメチル）の濃度を測定は、イヌの口内にシリンジを差し込んで採取した呼気1mlをオーラルクロマに注入し、自動測定した。
【結果】ヒトと比較して非常に高濃度のVSCがイヌで検出され、イヌの口内のVSC濃度は硫化水素>メチルメルカプタン>ジメチルサルファイドの順に高かった。食事摂取前後でVSC濃度に大きな変化はみられなかった。VSC濃度は官能試験スコア、イヌの年齢および歯石指標ならびに歯肉炎指標と正の相関がみられた。
【考察・結論】以上の成績より、VSCはイヌにおいても口臭の原因物質であり、加齢および歯周病と密接に関連することが示唆された。呼気中VSC濃度の測定は、イヌの口臭の定量化および歯周病の危険性予測を可能にするのに有用な方法と考えられる。
【総括】第一章の成績より、P. gulaeはイヌとネコに共通した重要な歯周病原性細菌であり、FimAの多様性が病原性に関与することが明らかとなった。そのため、P. gulaeのFimA型の検出は伴侶動物の歯周病リスクを予測することに有用であることが考えられる。第二章の成績より、呼気中VSCはイヌの口臭原因物質であり、その濃度は年齢および歯周病と密接に関連することが示唆された。},
 school = {麻布大学},
 title = {伴侶動物の歯周病に関する研究},
 year = {}
}