{"created":"2023-06-19T07:19:14.698936+00:00","id":5194,"links":{},"metadata":{"_buckets":{"deposit":"00c27a84-0a60-47c7-9cd5-320ff9502d39"},"_deposit":{"created_by":4,"id":"5194","owners":[4],"pid":{"revision_id":0,"type":"depid","value":"5194"},"status":"published"},"_oai":{"id":"oai:az.repo.nii.ac.jp:00005194","sets":["370:193:375"]},"author_link":["22638"],"item_10006_date_granted_11":{"attribute_name":"学位授与年月日","attribute_value_mlt":[{"subitem_dategranted":"2018-03-15"}]},"item_10006_degree_grantor_9":{"attribute_name":"学位授与機関","attribute_value_mlt":[{"subitem_degreegrantor":[{"subitem_degreegrantor_name":"麻布大学"}],"subitem_degreegrantor_identifier":[{"subitem_degreegrantor_identifier_name":"32701","subitem_degreegrantor_identifier_scheme":"kakenhi"}]}]},"item_10006_degree_name_8":{"attribute_name":"学位名","attribute_value_mlt":[{"subitem_degreename":"博士(学術)"}]},"item_10006_description_22":{"attribute_name":"Abstract","attribute_value_mlt":[{"subitem_description":"Genome editing technologies including ZFNs, TALENs and CRISPR/Cas9 system are now available in various organisms even in domestic animals. It is also thought that CRISPR/Cas9 system would facilitate genome editing compared with by using ZFNs or TALENs. In addition, genome editing by using CRISPR/Cas9 system could directly apply to embryos at the pro-nuclear stage (PN embryos) by microinjection of DNAs, RNAs or proteins which induce targeted double-stranded breaks without through somatic cell nuclear transfer, or embryonic stem cells. However, in many reports on successful production of knock-out pigs, the nuclear transfer method is mainstream, because the optimal conditions of microinjection into porcine embryos has not been clarified. Furthermore, it is difficult to obtain a lot of early embryos such as PN embryos, because rates of embryo production in vitro are still low and that the embryo cryopreservation is pretty difficult in the pig. Therefore, in the present study, the cryopreservation of PN embryos in pigs was first tried to improve. The in vitro and in vivo development of the PN embryos cryopreserved using the solution supplemented with EG and COOH-PLL were evaluated. The in vitro developmental rate of cryopreserved embryos was improved by the vitrification solution supplemented with 20% (w/v) COOH-PLL, and to confirm in vivo development of cryopreserved embryos, the embryo transfer was performed. The offspring derived from the vitified/warmed embryos was obtained. \nSecondly, the effects of various concentrations of gRNA and mRNA or protein of Cas9 which targeted the gene of porcine LIF on rates of in vitro development to blastocycts and induction rates of the gene mutation in fresh and cryopreserved PN embryos were evaluated. The results showed that there were no significant (P > 0.05) differences in the blastocyst rates of the fresh and cryopreserved PN embryos microinjected to different concentrations of gRNA and Cas9 mRNA or protein. However, the rates of gene mutation of the fresh PN embryos microinjected to 25 ng/µL gRNA + Cas9 mRNA was significantly higher (P < 0.05) than that of fresh PN embryos microinjected to 5 ng/µL gRNA + Cas9 mRNA. However, the fresh and cryopreserved embryos which microinjected to 25 ng/µL gRNA + Cas9 protein and transferred, did not develop to fetus in the uteri of recipients. Therefore, whether the LIF is conserned with the blastocysts development was investigated. In the results, LIF and LIF receptor were expressed in porcine blastocysts, therefore it suggested that LIF may work in blastocysts. Further research is required to clarify the role of LIF in porcine embryo development.　In conclusion, cryopreservation method for porcine PN embryos was successfully improved and the results showed the rates of gene mutation were affected by the concentration of gRNA + Cas9 mRNA. Furthermore, it is confirmed that cryopreserved PN porcine embryos could develop into blastocysts after the microinjection of gRNA + Cas9 mRNA or protein. The findings of the present study would contribute to the efficient production of the genetic modification pigs."}]},"item_10006_description_7":{"attribute_name":"抄録","attribute_value_mlt":[{"subitem_description":"【序論】ブタは家畜として優れた繁殖能力や発育能力を有し、食料供給源として人類に大きく貢献している。また、その臓器のサイズおよび形態はヒトとの類似性が高く、ヒトへの臓器提供動物あるいは疾患モデル動物としても非常に有用である。人類は優秀な動物を選抜して繁殖させる方法で利用目的に適した家畜を作り出し、そこへ人工授精・胚移植等の技術を適用して、家畜の改良を効率的に行ってきた。しかし、この手法は改良に非常に多大な時間を要する。そこで人類が解決しなければならない食料増産等の解決法の１つとして、ゲノムレベルでの動物の機能や形質を改良する手法が有望視されている。そして、遺伝子組換えや遺伝子ノックアウト(KO）動物の作出が試みられ、多くの生物現象や疾病の解明等、様々な利活用が報告されてきた。このゲノムレベルでの動物の改良は、研究の初期段階では初期胚を含む未分化な生殖系列の細胞に対する遺伝子断片の顕微注入操作等によって行われていたが、目的個体作出には操作胚由来の個体からさらに交配を重ねる必要がある。また、マウス・ラット以外の種では生殖系列に分化する胚性幹(ES）細胞株は確立しておらず、家畜では相同組換えした体細胞を核移植することでゲノムレベルで動物を改良していた。しかし、体細胞の相同組換え率が低率であるばかりでなく、核移植後の胚の発育能が著しく低いことが問題で、家畜における遺伝子改変動物作出の報告は少ない。しかし、近年開発されたゲノム編集技術のCRISPR/Cas9システムを用いることで家畜でもゲノム編集動物作出が従来法より簡便に行える可能性が示唆された。しかし、このCRISPR/Cas9システムは、前核期胚へ直接核酸等を導入してゲノム変異を高率に誘起できるが、ブタでは生体からの胚採取には手術を要すること、また、体外受精による受精率が低いことから、前核期胚を多数準備することは難しい。さらに、CRISPR/Cas9システムの前核期胚への至適導入条件が明らかでないことから、効率的にゲノム編集個体を作出することは難しい。 \n　本研究は、ゲノム編集ブタの効率的な作出システムの構築を最終的な目的に研究を行った。第一章では新規凍害保護物質カルボキシル基導入ポリリジン（COOH-PLL）を利用した前核期胚のガラス化保存の改良を試みた。第二章では CRISPR/Cas9システムの効率化を目的とし、前核期胚へのCRISPR/Cas9システムの導入条件が体外での発生能および胚盤胞でのゲノム編集率に及ぼす影響を検討した。第三章ではガラス化保存前核期胚へのgRNAおよびCas9注入後の発生能について調べた。\n第一章　新規凍害保護物質を用いたブタ前核期胚のガラス化保存法の改良\n【目的】ブタ前核期胚は細胞サイズが大きいことや、細胞質脂肪滴が存在すること等から低温感受性が高く、超低温保存後の発生能が低下することが知られている。本研究では新規凍害保護物質であるカルボキシル基導入ポリリジン（COOH-PLL）を添加した保存液がブタ前核期胚の体外での発生能に及ぼす影響を検討した。さらに、本保存液によりガラス化保存した前核期胚が産子への発育能を有するかを調べた。\n【方法】食肉処理場由来卵巣より回収した未成熟卵を体外成熟培養し、得られた成熟卵を凍結融解精子と体外受精し、前核期胚を得た。前核期胚は、30% (v/v) ethylene glycol (EG) およびCOOH-PLL を0、1、10、20、30% (w/v)添加した保存液(P0、P1、P10、P20、P30)を用いてガラス化保存し、加温後に体外発生培養を行い生存率および発生率を調べた。また、最も高い胚盤胞率を示したP20でガラス化保存したブタ前核期胚を発情同期化したブタへ外科的に胚移植し、産子への発生能を調べた。\n【結果】P0、P1、P10、P20およびP30でガラス化保存した胚の生存率は、それぞれ91.8%、86.7%、85.4%、80.7%および76.8%で、試験区間に有意な差はなかった(P > 0.05)。P0、P1、P10、P20およびP30でガラス化保存した胚の2-4細胞期胚率はそれぞれ23.1%、27.5%、37.8%、41.7%、39.7%であり、P0およびP1において対照区(56.7%)と比較して発生率は低下した(P < 0.05)。また、胚盤胞率はそれぞれ1.3%、3.8%、12.2%、19.4%および4.8%であり、P20はP0よりも有意に高く(P < 0.05)、対照区(28.4%)と有意差のない値を示した(P > 0.05)。さらに、P20でガラス化保存した前核期胚を移植した8頭のレシピエント中2頭が妊娠、分娩をし、計15頭の産子が得られた。以上の結果より、20% (w/v) COOH-PLL添加保存液によりガラス化保存したブタ前核期胚の胚盤胞への発生能は向上し、産子への発育能を有することが示された。\n第二章　ブタ前核期胚へのCRISPR/Cas9システム導入条件の検討\n【目的】CRISPR/Cas9システムは、標的配列を認識するgRNAがヌクレアーゼであるCas9を呼び込み、標的配列を切断する。前核期胚に導入する際には一般的にgRNAとCas9のmRNAやタンパク質を細胞質注入する必要がある。しかし、ブタでは最適な導入条件は明らかになっていない。本研究では、マウスにおいて着床に必須であるとされるLeukemia Inhibitory Factor (LIF)を標的としたgRNAの作製を行い、作製したgRNAおよびCas9 mRNAあるいはタンパク質を前核期胚に注入し、その後の体外での発生能および胚盤胞のゲノム編集率を調べた。\n【方法】gRNA はCRISPR directツールを使用して設計した。複数作製したgRNAのうち、最も切断効率が高いgRNAを選別するため、体細胞にgRNAとCas9を共発現するプラスミドを導入し、最も切断効率の高いgRNAを前核期胚の注入に用いた。gRNAおよびCas9発現プラスミドはin vitro転写を行い、Nuclease free waterで希釈した。第一章と同様の方法で作製した前核期胚に、 5 ng/µL gRNA＋Cas9 mRNA (R5)、12.5 ng/µL gRNA＋Cas9 mRNA (R12.5)、25 ng/µL gRNA＋Cas9 mRNA (R25)あるいは 50 ng/µL gRNA＋Cas9 mRNA (R50)を注入し、生存率および胚盤胞への発生率を調べた。対照群として、注入を行わなかった無処理区およびgRNAやCas9の希釈液を注入したSham区についても同様に生存率と発生率を調べた。さらに、10 ng/µL gRNA＋Cas9 タンパク質 (Pro10)、25 ng/µL gRNA＋Cas9 タンパク質(Pro25)あるいは50 ng/µL gRNA＋Cas9 タンパク質(Pro50)を注入し、同様に生存率および胚盤胞率を調べた。得られた胚盤胞は回収し、PCR産物のダイレクトシークエンスによりゲノム編異率を調べた。\n【結果】gRNAおよびCas9 mRNAを注入した前核期胚の生存率は無処理区において100%、Sham区において77.6%、R5において61.7%、R12.5において64.6%、R25において67.6%、R50において67.9%であり、Sham区を含む顕微注入を行ったすべての試験区において生存率は低下した(P < 0。05)。胚盤胞率は無処理区において34.2%、Sham区において16.5%、R5において17.7%、R12.5において18.2%、R25において17.5%、R50において14.4%であり、試験区間に有意な差はみられなかった(P > 0.05)。gRNAおよびCas9 タンパク質を注入した前核期胚の生存率はPro10において72.7%、Pro25において75.0%、Pro50において64.3%であり、無処理区(100%)およびSham区(76.0%)と比較して有意に低い生存率を示した(P < 0.05)。胚盤胞率は、無処理区において36.7%、Sham区において8%、Pro10において9.1%、Pro25において14.3%、Pro50において12.5%であり、試験区間に差はみられなかった(P > 0.05)。gRNAおよびCas9 mRNAを注入した前核期胚由来胚盤胞を回収し遺伝子型解析を行った結果、 R5において7.7%、R12.5において40.0%、R25において50.0%、R50において12.5%であり、R25はR5と比較して高いゲノム編異率を示した(P < 0.05)。本研究により、gRNAおよびCas9 mRNAあるいはタンパク質の前核期胚への注入は、胚の生存性を低下させるものの、胚盤胞への発生能には影響を及ぼさないことを示した。また、本研究の結果よりR25において最も高いゲノム編集率を示したため、効率よくゲノム編集胚を作出するためには適切な濃度のgRNAおよびCas9 mRNAを注入する必要があると考えられる。 \n第三章　ガラス化保存ブタ前核期胚へのgRNAおよびCas9注入後における発生能の検討\n【目的】ブタ前核期胚は低温感受性が高く、ガラス化保存が難しいことに加え、顕微操作を伴う核酸の注入は胚への物理的なダメージが大きく、これまでにガラス化保存した前核期胚を用いて遺伝子改変動物を作出したという報告はされていない。そこで、第一章により確立した20% (w/v) COOH-PLL添加液を用いてガラス化保存したブタ前核期胚にgRNAおよびCas9を注入し、その後の発生能を評価した。 \n【方法】第一章と同様の方法で作出した前核期胚を20% (w/v) COOH-PLL添加液を用いてガラス化保存し、加温後にgRNAおよびCas9 mRNAあるいはタンパク質を注入し、体外発生培養後の生存率および発生率を調べた。注入試験区は第二章と同様に設定した。さらに、Pro25を注入した新鮮およびガラス化前核期胚を胚移植し、28日後に子宮を採取し胎子の作出を試みた。\n【結果】gRNAおよびCas9 mRNAを注入したガラス化保存前核期胚の生存率は無処理区において100%、Sham区において8.3%、R5において31.8%、R12.5において31.6%、R25において50%であり、Sham区では生存率は低下した(P < 0.05)。胚盤胞率は無処理区において9.1%、Sham区において0%、R5において13.6%、R12.5において0%、R25において9.1%であり、試験区間に有意な差はみられなかった(P > 0.05)。gRNAおよびCas9タンパク質を注入したガラス化保存前核期胚の生存率は無処理区において59.5%、Sham区において32.4%、Pro10において27.0%、Pro25において34.2%、Pro50において16.2%であり、Pro50は無処理区と比較して有意に低い生存率を示した(P < 0.01)。胚盤胞率は無処理区において2.7%、Sham区において%、Pro10において2.7%、Pro25において5.4%、Pro50において5.3%であった。Pro25を注入した新鮮およびガラス化前核期胚を胚移植した結果、胎子は確認できず、また着床痕も観察されなかった。以上の結果より、ガラス化保存したブタ前核期胚にgRNAおよびCas9を注入した結果、胚盤胞に発生することが示された。また、胚移植後に胎子への発育は確認されなかったが、LIFは胚の発生にも関与しているため、ゲノム編集が生じLIFが欠損し着床がみられなかった可能性もあり、胚におけるLIFの役割についてさらなる研究が必要であると考えられる。\n　本研究により、ブタ前核期胚のガラス化保存法の改良に成功し、CRISPR/Cas9システムの導入条件が胚の生存性とゲノム編集率に影響を及ぼすことを示した。さらに、CRISPR/Cas9システムを導入したガラス化保存ブタ前核期胚が胚盤胞への発生能を有することをはじめて明らかにした。本研究の成果は、ゲノム編集ブタ作出の効率化に有用であると考えられる。\n"}]},"item_10006_dissertation_number_12":{"attribute_name":"学位授与番号","attribute_value_mlt":[{"subitem_dissertationnumber":"甲第71号"}]},"item_10006_textarea_23":{"attribute_name":"Rights","attribute_value_mlt":[{"subitem_textarea_value":"本論文の一部は以下のとおり公表されている。(Part of this dissertation has been published as follows.)\nKamoshita M, Kato T, Fujiwara K, Namiki T, Matsumura K, Hyon SH, Ito J, Kashiwazaki N. Successful vitrification of pronuclear-stage pig embryos with a novel cryoprotective agent, carboxylated epsilon-poly-L-lysine.  \nPLoS One 2017; 12:e0176711."}]},"item_10006_version_type_18":{"attribute_name":"著者版フラグ","attribute_value_mlt":[{"subitem_version_resource":"http://purl.org/coar/version/c_970fb48d4fbd8a85","subitem_version_type":"VoR"}]},"item_access_right":{"attribute_name":"アクセス権","attribute_value_mlt":[{"subitem_access_right":"open access","subitem_access_right_uri":"http://purl.org/coar/access_right/c_abf2"}]},"item_creator":{"attribute_name":"著者","attribute_type":"creator","attribute_value_mlt":[{"creatorNames":[{"creatorName":"鴨下, 真紀"}],"nameIdentifiers":[{}]}]},"item_files":{"attribute_name":"ファイル情報","attribute_type":"file","attribute_value_mlt":[{"accessrole":"open_date","date":[{"dateType":"Available","dateValue":"2019-03-15"}],"displaytype":"detail","filename":"diss_da_kou0071.pdf","filesize":[{"value":"1.7 MB"}],"format":"application/pdf","licensetype":"license_note","mimetype":"application/pdf","url":{"label":"diss_da_kou0071","url":"https://az.repo.nii.ac.jp/record/5194/files/diss_da_kou0071.pdf"},"version_id":"95c8477c-0591-4c6a-ad3e-92d7c28bbbf4"},{"accessrole":"open_date","date":[{"dateType":"Available","dateValue":"2018-03-22"}],"displaytype":"detail","filename":"diss_da_kou0071_jab&rev.pdf","filesize":[{"value":"218.0 kB"}],"format":"application/pdf","licensetype":"license_note","mimetype":"application/pdf","url":{"label":"diss_da_kou0071_jab&rev.pdf","url":"https://az.repo.nii.ac.jp/record/5194/files/diss_da_kou0071_jab&rev.pdf"},"version_id":"29820938-e97f-4980-8976-6d3650d38957"}]},"item_language":{"attribute_name":"言語","attribute_value_mlt":[{"subitem_language":"jpn"}]},"item_resource_type":{"attribute_name":"資源タイプ","attribute_value_mlt":[{"resourcetype":"doctoral thesis"}]},"item_title":"ゲノム編集のためのブタ前核期胚のガラス化保存法およびCRISPR/Cas9システムの導入条件に関する研究","item_titles":{"attribute_name":"タイトル","attribute_value_mlt":[{"subitem_title":"ゲノム編集のためのブタ前核期胚のガラス化保存法およびCRISPR/Cas9システムの導入条件に関する研究"},{"subitem_title":"The studies on improving embryo vitrification and introduction conditions of CRISPR/Cas9 system into embryos at the pronuclear stage for genome editing in pigs","subitem_title_language":"en"}]},"item_type_id":"10006","owner":"4","path":["375"],"pubdate":{"attribute_name":"公開日","attribute_value":"2018-03-22"},"publish_date":"2018-03-22","publish_status":"0","recid":"5194","relation_version_is_last":true,"title":["ゲノム編集のためのブタ前核期胚のガラス化保存法およびCRISPR/Cas9システムの導入条件に関する研究"],"weko_creator_id":"4","weko_shared_id":4},"updated":"2023-06-19T07:42:29.615197+00:00"}