WEKO3
アイテム
エルシニア症ワクチン開発に関する研究
https://az.repo.nii.ac.jp/records/4547
https://az.repo.nii.ac.jp/records/45479fad4686-69c6-453a-89ed-7ed874dc945c
| 名前 / ファイル | ライセンス | アクション |
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diss_dv_kou0149 (6.1 MB)
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diss_dv_kou0149_jab&rev.pdf (231.3 kB)
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| Item type | 学位論文 / Thesis or Dissertation(1) | |||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 公開日 | 2017-03-27 | |||||||||
| タイトル | ||||||||||
| タイトル | エルシニア症ワクチン開発に関する研究 | |||||||||
| タイトル | ||||||||||
| タイトル | The study of the vaccine of yersiniosis | |||||||||
| 言語 | en | |||||||||
| 言語 | ||||||||||
| 言語 | jpn | |||||||||
| 資源タイプ | ||||||||||
| 資源タイプ | doctoral thesis | |||||||||
| アクセス権 | ||||||||||
| アクセス権 | open access | |||||||||
| アクセス権URI | http://purl.org/coar/access_right/c_abf2 | |||||||||
| 著者 |
津郷, 孝輔
× 津郷, 孝輔
× Tsugo, Kosuke
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| 抄録 | ||||||||||
| 内容記述タイプ | Abstract | |||||||||
| 内容記述 | 緒言 Yersinia pseudotuberculosisは、腸内細菌科に属するグラム陰性の短桿菌で、人獣共通感染症であるエルシニア症の原因菌である。Y. pseudotuberculosisは、様々な動物に病原性を示し、サル類、コウモリ、鳥類などで感染、致死的流行事例が世界中で報告されている。中でも、サル類は本菌に特に高感受性で、これまでに希少動物であるチンパンジーやオラウータンも含めた様々なサルのY. pseudotuberculosis感染による致死事例が報告されている。わが国では、特にリスザルでの流行が深刻であり、主に関東以西の様々な施設で流行している。Y. pseudotuberculosisに感染すると、感染動物は重篤な急性腸管感染症を引き起こし敗血症化して死に至る。サルのエルシニア症は急性感染症で、発見段階ですでに重篤化していることが多いため、治療は困難で、さらに末期での抗生物質投与はエンドトキシンショックを招来する危険性がある。また、衛生管理と自然宿主（感染源）とされる鳥類や齧歯類などとの接触を阻止することが、現在唯一の予防法であるが、これらの動物は小型で、あるいは飛翔することもあって動物園の『動物を展示する』といった目的を果たしつつY. pseudotuberculosisとの接触を回避することは至難であり、ワクチンなどの予防法確立が急務であった。これまで我々はY. pseudotuberculosisがもつ接着因子のひとつYersinia adhesin A（YadA）を強発現させたY. pseudotuberculosisをホルマリンで不活化したワクチンで、エルシニア症をコントロールしてきた。しかし、このワクチンには、①作製手順が煩雑で、しかも作製者への感染リスクがある、② 皮下投与をするため動物の捕獲や麻酔が必須で、術者、動物双方の安全が危ぶまれる、③ 腸管局所免疫が誘導できないため感染を阻止できない、といった問題がある。そこで本研究では、問題点①については、遺伝子組み換え大腸菌を用いて組換えYadA（以下、rYadA）を作製し、②と③に対しては、体内薬物輸送システムDrug Delivery System（DDS）を考慮した経口ワクチン開発を行うことによって解決を試みた。 本研究の目的は、サル類のエルシニア症感染を阻止するための腸管局所免疫を誘導可能な、経口投与型ワクチンの開発である。 第一章 遺伝子組換え大腸菌による、rYadAの作製 rYadAを作製するために、まず遺伝子組換え大腸菌の作製を行った。本学病理学研究室が所有する5株のY. pseudotuberculosis（阪大4b, 16M, 04M, 7M, コウモリ由来）がもつYadA遺伝子（yadA; 単量体で全長1,299bp）をシークエンス解析したところ、既存のデータベースと比較して、阪大O4b株が最も相同性が高かったため、この株のyadAを用いて組換え大腸菌を作製した。Y. pseudotuberculosis阪大O4b株より抽出したyadAは、3種類のベクターを用いて大腸菌に形質転換させ、組換え大腸菌株4株（PS, BX, Ⅲ, TF）を作製した。このうち、ベクターpGEX-6p-1を用いた株（以下PS, BX株）ではrYadAは水に不溶性の封入体物として発現し、pCold-TF（以下TF株）とpCold-Ⅲ（Ⅲ株）を用いた株では、水に可溶性のタンパクとして確認された。そして、PS, BX株については酵素切断部位以外はすべて同一であっため、今後の実験にはPS株を用いることとした。また、Ⅲ株は、可溶性タンパクとして発現したが、精製するための担体がなく、精製できないことから使用しないこととした。TF株については、担体があり、金属アフィニティークロマトグラフィーで精製可能であったため、精製し使用することとした。データベース上では、YadAは、可溶性タンパクとして記載されており、菌体の膜に発現しているとされるがPS, BX株では、大腸菌の細胞質内で発現し、立体構造が変わってしまったために不溶性の封入体として回収されたと考えた。原因としては、精製用の担体としてYadAのN末端に発現しているGSTの影響、ベクターの性能、YadAの全長が大腸菌遺伝子に組み込むためには長すぎた可能性などが考えられたが、本実験では解明できなかった。 結論、本実験では、4種の組換え大腸菌株の作製に成功し、免疫原として使用しやすい2株（PSとTF株）を選定し、以降の実験に使用した。 第二章 rYadAの皮下投与による免疫原性の評価 第一章で作成したrYadAの免疫原性を感染実験により評価した。BALB/cマウスを、①群：PS株由来不溶性rYadA100µg ②群：TF株由来可溶性rYadA100µg ③群：不活化Y. pseudotuberculosis 20mg ④群：PBS 0.2mlに分け、1週間おきに2回皮下投与し、その後Y. pseudotuberculosis生菌を107個経口投与して2週間観察した。その後、1) ELISAによる、rYadAおよびY. pseudotuberculosis特異IgG抗体価、2) 生存率 3) 病理学的検索により効果を判定した。ELISAによるマウスの抗体価は、①群では、rYadA特異IgG抗体価のみが有意に上昇した。③群では、rYadAおよびY. pseudotuberculosis特異IgG抗体価が有意に上昇した。また、免疫後暴露実験では、②と④群はY. pseudotuberculosis経口感染後12日以内にすべて死亡した。一方で、①群では生存率100%、③群では60%と、有意な差がみられた。また、肉眼的には、死亡した個体にはすべてエルシニア症に特徴的な、脾臓の腫大、脾臓、肝臓の多発性白色結節、パイエル板、腸間膜リンパ節の腫大がみられたが、生存した①と③群ではパイエル板、腸間膜リンパ節は高度に腫大していたものの、脾臓、肝臓の病変は軽度で、組織学的にも、Y. pseudotuberculosis感染で死亡した動物にみられるような壊死性病変はなく、マクロファージや線維芽細胞の浸潤を主とする器質化病変であり、これはY. pseudotuberculosisに対する免疫が働いた結果、組織修復が起きたと考えられた。 以上の結果から、作製したrYadAが免疫原として有効であること、また、生存率の違いから、従来の不活化Y. pseudotuberculosisワクチンよりもエルシニア症に対する防御効果が期待できることが示された。また、病理学的な所見からも、腸管から全身に移行した菌が起こす障害をある程度阻止していることが示されたことから、rYadAが病態悪化を阻止していることが明らかになった。 第三章 rYadA経口投与による免疫原性の評価 経口投与による効果を病理学的、微生物学的および免疫学的に評価した。ICRマウスを用いて、①群：rYadA経口投与群100µg ②群：500µg ③群：1000µgで週１回ずつ2回投与し、ELISAで糞中rYadA特異IgA抗体価を測定したところ、すべての群でrYadA特異IgA抗体価の上昇がみられたが、用量によって抗体保有期間が異なっており、②群で最長で、3週間持続し、①群で2週間、③群で1週間であった。また、脾臓中の1g当たりの菌量も、対照群より比較的少なかった。これらの結果を勘案して、500µg が最も適当な投与量と考え、BALB/cマウスを用いて500µg /匹を1週間ごとに計2回経口投与後、暴露実験を行った。その結果、生存率は100%であった。 よって、経口投与によっても防御効果があることが示された。しかし、血清中rYadA特異IgG抗体価は上昇せず、また、第2章の耐過マウスと同様にパイエル板は腫大し、脾臓、肝臓に器質化病変もみられた。よって、病態悪化を阻止する全身免疫は誘導できず、また、今回の実験で得られた糞便中の抗体価では、腸管局所における感染阻止に至らないことが分かった。他の研究では、特異IgAの誘導のみでは感染防御ができないという報告もあるが、さらなる高力価のIgA抗体と全身免疫付与の検討のため、粘膜アジュバント、DDSを考慮した担体などを用いて、より高力価で、持続時間の長い特異IgAの賦与を目指して至適条件（投与回数や期間など）を検討したい。 第四章 リスザルを用いた臨床実験 1．リスザルでのワクチン効果を検証するため、エルシニア症流行施設であるA施設（100頭前後飼育）とB施設（60頭前後飼育）に協力を依頼し、ワクチン投与実験を行った。それぞれの施設で、年１回リスザル全頭を捕獲し、2005～2011年までは不活化Y. pseudotuberculosisワクチン、2012～2013年までは不活化ワクチンとrYadAの混合ワクチン、2014年以降はrYadAワクチンを皮下投与し、Y. pseudotuberculosisとrYadAに対するそれぞれの抗体価を測定した。ワクチン接種時に直腸スワブを採取し、Y. pseudotuberculosisの保菌状況を確認した。並行して、ワクチン投与期間中に死亡したサルの病性鑑定を行い、エルシニア症発生状況を把握した。 その結果、両施設のサルのYadA抗体価の平均値は、A施設ではワクチン投与開始当初は低値であったが、5年後には初年の1.7倍程度に上昇した。一方B施設における抗体価の平均値はA施設より高いものの、栄養状態や気候などによって年ごとに変動した。そして、エルシニア症はB施設でのみ発生して2002年より22頭が死亡し、1例を除いていずれも抗体価の低い1歳未満の個体であった。さらに、2つの施設で、0～1歳時から、継続して抗体価が測定できたサルを対象として、抗体価の推移を追跡したところ、ワクチン投与ごとに抗体価は上昇していったが、B施設では、無反応あるいは上昇が低調な個体が54％もいた。直腸スワブの培養検査では、2014年にA施設からY. pseudotuberculosis血清型O3と血清型不明株がそれぞれ1例ずつ検出されたのみであった。以上より、A施設では、rYadAワクチンによりエルシニア症の流行を阻止できたが、B施設では、エルシニア症のコントロールが不十分であった。その理由として、ワクチン無反応個体が多いこと、外的要因によって抗体価の変動がしばしばおこること、自然宿主との接触機会が多い施設環境、エルシニア症個体から分離されるY. pseudotuberculosis血清型の変化などが考えられた。 2．リスザルにおけるrYadA経口投与型ワクチンの試み、リスザル3頭を用いて、No.1：rYadA 100µg No.2:500µg No.3：1,000µgとして、週１回、計3回経口投与し、３週間にわたって糞中rYadA特異IgA抗体価を測定した。その結果、No.2とNo.3は、投与回数に正比例して抗体価が上昇し、抗体価はワクチン投与後３週間維持された。また、一時的に血中rYadA特異IgG抗体の上昇もあった。本実験によって、リスザルへのrYadA経口投与による局所免疫付与が示唆された。 |
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| Abstract | ||||||||||
| 内容記述タイプ | Other | |||||||||
| 内容記述 | Introduction Yersinia pseudotuberculosis is a gram-negative short bacillus belonging to the family Enterobacteriaceae and a cause for yersiniosis which is a zoonosis. Y. pseudotuberculosis has pathogenicity in various animals such as monkeys, bats, birds and so on, and causes fatal epidemics in around the world. Among them, monkeys are particularly sensitive to Y. pseudotuberculosis, and fatal cases due to yersiniosis of various monkeys including chimpanzees and orangutans which are rare animals have been reported so far as known. In Japan, especially, squirrel monkeys have serious epidemic in various facilities mainly in the west of the Kanto region. When infected with Y. pseudotuberculosis, the infected animal develops severe acute intestinal infection causing sepsis and death. Yersinosis in monkeys is an acute infection, it is often difficult to treat because it is severe at the time of finding, and administration of antibiotics at late stage of illness is risking endotoxin shock. Also, currently prophylactic methods are only hygiene control and preventing contact birds and rodents, which are regarded as natural hosts (infection sources), but these animals are small or flying, so it is extremely difficult to avoid contact with Y. pseudotuberculosis while fulfilling the purpose of "exhibiting animals" at the zoo, so establishment of preventive method such as vaccine was urgent. We have controlled yersiniosis by inactivating Y. pseudotuberculosis with formalin, which strongly expressed Yersinia adhesin A (YadA), one of the adhesion factors of Y. pseudotuberculosis. However, this vaccine has the following problems : ① The preparation procedure is complicated and there is a risk of infection to the maker, ② Capture of animals and anesthesia are essential for subcutaneous administration, so both the surgeon and the animal is dangerous, ③ There is a problem that infection can not be prevented because intestinal local immunity can not be induced. Therefore, in this study, the solution for the ploblem ①, we used recombinant YadA (rYadA) that is extracted from Escherichia coli of genetic recombination, and we considered Drug Delivery System (DDS) for in vivo drug transport system for ② and ③, we tried to solve it by developing an oral vaccine. The purpose of this study is to develop an orally administered vaccine that can be inducing intestinal local immunity to prevent yersiniosis in monkeys. Chapter 1. Preparation of rYadA by recombinant E. coli For producing rYadA, firstly genetic recombinant E. coli was made. Sequence analysis of the YadA gene (yadA; monomer, total length 1,299 bp) possessed by 5 strains of Y. pseudotuberculosis (Handai O4b, 16M, 04M, 7M, Bat) owned by the laboratory of veterinary pathology in Azabu univ was carried out. Then, as compared with that of the existing database, since Handai O4b strain had the highest homology, recombinant E. coli was made using yadA gene from this strain. The yadA gene extracted from Handai O4b was transformed into E. coli using three kinds of vectors and four strains (PS, BX, III, TF) of recombinant E. coli strain were made. Among these, rYadA of a strain using the vector pGEX-6p-1 (PS and BX strain) was expressed as an insoluble inclusion body, and rYadA from pCold-TF (TF strain) and pCold-Ⅲ (Ⅲ strain) was expressed as a soluble protein. For this reason, PS and BX strains are all the same except for enzyme cleavage sites, so we decided to use PS strain for future experiments. In addition, strain Ⅲ was expressed as a soluble protein, but it was decided not to use because it can not be purified because it has no carrier for purification. For the TF strain, it hs a carrier, which was purifiable by metal affinity chromatography, so it was decided to use it for purification. On the database, YadA is described as a soluble protein and it is expressed on the membrane of Y. pseudotuberculosis. PS and BX strain’s rYadA was expressed in the cytoplasm of E. coli and caused a change in three-dimensional structure, so it was thought that rYadA was expressed as an insoluble inclusion body. It is thought that this was caused the influence of the purification carrier GST expressed on the N-terminal of YadA, the performance of the vector, the full length of YadA is too long to transform into the E. coli, but it could not be clarified by experiments. Conclusion In this experiment, we succeeded in producing four recombinant E. coli strains and selected two strains (PS and TF) which were easy to use as immunogens and were used for the subsequent experiments. Chapter 2. The study of immunogenicity by rYadA subcutaneous administration The immunogenicity of rYadA made in Chapter 1 was evaluated by challenging Y. pseudotuberculosis. BALB / c mice were divided into ① group: insoluble rYadA derived from PS strain 100 μg ② group: soluble rYadA derived from TF strain 100 μg ③ group: inactivated Y. pseudotuberculosis 20 mg ④ group: 0.2 ml of PBS, administered subcutaneously twice at intervals of one week. After, 107 orally administered Y. pseudotuberculosis were orally administered and observed for 2 weeks. Thereafter, The effect of vaccines was compared by 1) ELISA, rYadA, Y. pseudotuberculosis specific IgG antibody titer, 2) survival rate 3) pathological findings. The antibody titers of mice by ELISA were significantly elevated in rYadA-specific IgG antibody titer in ① group. In Group ③, rYadA and Y. pseudotuberculosis specific IgG antibody titer increased significantly. Also, in the challenging Y. pseudotuberculosis, all of mice in ② and ④ groups died within 12 days after infected Y. pseudotuberculosis. On the other hand, there was a significant difference between the survival rate of 100% in ① group and 60% in ③ group.Also, macroscopically, the severe spleen enlargement, multiple white nodules in spleen and liver, Peyer 's patches and mesenteric lymph nodes all of which were characteristic of yersiniosis was observed in all mouse who died , Peyer's patches and mesenteric lymph nodes were severe in surviving mice ① and ③ group, but spleen and liver lesions were mild. Histologically, there were no necrotic lesion like yersisniosis and it was that a lesion of spleen and liver was mainly infiltration of macrophages and fibroblasts in surviving mice, and it was thought that tissue repair occurred as a result of immunity against Y. pseudotuberculosis. From the result, it was revealed that the produced rYadA is effective as an immunogen, and that the protective effect against yersiniosis can be expected from the inactivated Y. pseudotuberculosis vaccine as compared with the difference in survival rate. The pathological findings also showed that rYadA inhibited to the disorder caused by Y. pseudotuberculosis transferred from the intestinal tract to the whole body. So it revealed that rYadA prevented deteriorating of clinical conditions. Chapter 3. The study of immunogenicity by oral administration of rYadA The effect of oral administration was compared by pathologically, microbiologically and immunologically. Using ICR mice, ① group : rYadA oral administrated group 100 μg ② group: 500 μg ③ group: 1000 μg once a week and orally administered a total of 2 times, and measuring fecal rYadA specific IgA antibody titer in all groups. In all groups, increasing in rYadA specific IgA antibody titer was observed, but the immunization period varied depending on the administration, it was the longest in group ②, lasted 3 weeks, it was 2 weeks in group ① and 1 week in ③ group. In addition, the amount of Y. pseudotuberculosis per 1 g in the spleen was also relatively few in all the administrated group. Considering these results, exposure was carried out after 500 μg / mouse was orally administered once a week and a total of 2 times for 500 μg / mouse using BALB / c mouse. As a result, the survival rate was 100%. Therefore, it was revealed that rYadA had protective effect even by oral administration. However, serum rYadA specific IgG antibody titer did not rise, Peyer 's patch enlarged like the resistant mice of chapter 2 and mild to moderate characteristic lesions of yersiniosis were found in spleen and liver. Therefore, rYadA could not induce systemic immunity to prevent becoming advanced pathological lesions, and it was found that the fecal antibody titer in this experiment did not prevent infection in the intestinal tract. Furthermore, we will try to give antibodies with high titer in the future. However, other studies have reported that preventing infection could not be achieved only by induction of specific IgA. Therefore, in the future, we aim to give specific IgA and systemic immunity with higher titer, longer duration, by investigating IgA antibody titer effective for the preventing infection and using carriers such as mucosal adjuvant and DDS. So, we would like to study the optimal condition (frequency of administration, duration and etc.) Chapter 4. Clinical trials using squirrel monkeys 1. In order to verify the vaccine effect in squirrel monkeys, we asked for cooperation with A facility (breeding around 100 monkeys) and B facility (breeding around 60) to conduct a vaccine administration experiment. In each facility, all squirrel monkey capture and subcutaneously administered inactivated Y. pseudotuberculosis vaccine until 2005-2011, mixed vaccine of inactivated vaccine and rYadA until 2012-2013, rYadA vaccine after 2014, serum anti-Y. pseudotuberculosis and rYadA antibody titer was measured once a year. Rectal swabs were collected at the time of vaccination and the colonization status of Y. pseudotuberculosis was confirmed. In parallel, we monitored the lesion of the monkeys who died during the vaccine administration period for taking in the epidemic of yersiniosis. As a result, the average value of the YadA antibody titer of the monkeys of both facilities was low at the beginning of the vaccine administration at the A facility, but increased to about 1.7 times five years after. Although, the average value of antibody titer in facility B was higher than that in facility A, it varied from year to year depending on nutritional status and climate. Yersinosis occurred only in facility B, 22 deaths since 2002, and except for one case, all monkey was less than one year old with low antibody titer. Furthermore, the antibody titer was monitored for monkeys that were able to continuously measure the antibody titer from 0 to 1 year old at the two facilities, in A facility, the antibody titer increased with each administration of the vaccine, but in B facility, 54% of monkeys were unresponsive or low-elevated. In the culture of rectal swab, only one case of Y. pseudotuberculosis serotype O 3 and serotype unknown strain was detected from A facility in 2014. From the result, at the A facility, the rYadA vaccine could prevent the epidemic of yersiniosis, but at the B facility, the control of yersiniosis was insufficient. We thought the reasons were that there were many vaccine unresponsive monkeys, the frequent fluctuation of antibody titer caused external factors, the facility environment with many contact opportunities with natural hosts and the serotype isolated from dead monkeys for yersiniosis have been changing since 2011. 2. We investigated whether rYadA can be used as an orally administered vaccine for squirrel monkeys. 3 squirrel monkeys, once a week, orally administered a total of 3 times, as No.1 : rYadA 1,000 μg, No.2 : 500 μg and No.3 : 100 μg, and after once a week for a total of 3 times fecal rYadA specific IgA antibody titer was measured. As a result, in No. 1 and No.2, the antibody titer increased in direct proportion to the number of administrations, and the antibody titer was maintained for 3 weeks after administration of the vaccine. There was also a temporary rise in serum rYadA specific IgG antibody. This experiment suggested that local immunization of rYadA was induced to squirrel monkeys by oral administration. |
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| 学位名 | ||||||||||
| 学位名 | 博士(獣医学) | |||||||||
| 学位授与機関 | ||||||||||
| 学位授与機関識別子Scheme | kakenhi | |||||||||
| 学位授与機関識別子 | 32701 | |||||||||
| 学位授与機関名 | 麻布大学 | |||||||||
| 学位授与年月日 | ||||||||||
| 学位授与年月日 | 2017-03-15 | |||||||||
| 学位授与番号 | ||||||||||
| 学位授与番号 | 甲第149号 | |||||||||
| Rights | ||||||||||
| 値 | 本論文の一部は以下のとおり公表されている。(Part of this dissertation has been published as follows.) Tsugo, K., Nakamura, S., Yamanaka, H., Une, Y. A study of the efficacy for yersiniosis by the vaccine of recombinant Yersinia Adhesin A in early phase. J Vet Med Sci. doi: 10.1292/jvms.16-0528. |
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| 著者版フラグ | ||||||||||
| 出版タイプ | VoR | |||||||||
| 出版タイプResource | http://purl.org/coar/version/c_970fb48d4fbd8a85 | |||||||||
