{"created":"2023-06-19T07:18:54.820334+00:00","id":4535,"links":{},"metadata":{"_buckets":{"deposit":"e5c56b91-2c4e-4eb6-ae55-17c1ed96acfa"},"_deposit":{"created_by":4,"id":"4535","owners":[4],"pid":{"revision_id":0,"type":"depid","value":"4535"},"status":"published"},"_oai":{"id":"oai:az.repo.nii.ac.jp:00004535","sets":["370:15:391"]},"author_link":["19811","19810"],"item_10006_date_granted_11":{"attribute_name":"学位授与年月日","attribute_value_mlt":[{"subitem_dategranted":"2016-03-15"}]},"item_10006_degree_grantor_9":{"attribute_name":"学位授与機関","attribute_value_mlt":[{"subitem_degreegrantor":[{"subitem_degreegrantor_name":"麻布大学"}],"subitem_degreegrantor_identifier":[{"subitem_degreegrantor_identifier_name":"32701","subitem_degreegrantor_identifier_scheme":"kakenhi"}]}]},"item_10006_degree_name_8":{"attribute_name":"学位名","attribute_value_mlt":[{"subitem_degreename":"博士(獣医学)"}]},"item_10006_description_22":{"attribute_name":"Abstract","attribute_value_mlt":[{"subitem_description":"Introduction\nCanine atopic dermatitis (cAD) is a common, pruritic and allergic skin disease of dogs that shares several clinicopathological features with human atopic dermatitis (hAD). In hAD, periostin (PO) is assumed to play a critical role in the enhancement and chronicity of allergic skin inflammation; however, the pathogenesis of cAD involved of PO has been unknown. Also, the inducer of PO in the canine skin has not been clarified. Therefore in Chapter 1, the author investigated the expression of the PO protein and mRNA in healthy, atopic, and nonatopic inflamed skin in dogs. In Chapter 2, the author focused on IL-13 and TGF-β1 which were assumed to be inducing factor of PO, using skin tissues of cAD as well as canine cultured keratinocytes and dermal fibroblasts. Next, the function of PO was examined using culture canine keratinocytes by proliferation assay, microarray and real time quantitative RT-PCR. \n\nChapter 1: Expression of Periostin in Normal, Atopic, and Nonatopic Chronically Inflamed Canine Skin\nThe aim of this chapter was to examine the expression patterns of PO in healthy, atopic, and nonatopic chronically inflamed canine skin. Biopsy specimens from 47 dogs with skin disease, and normal skin tissue from 5 adult beagles were examined by light microscopy, immunohistochemistry (IHC), and in situ hybridization (ISH). In normal skin, PO was localized just beneath the epidermis and around the hair follicles. In chronically inflamed skin, PO　expression was most intense in the dermis with inflammatory cell infiltrates. In contrast, low levels of PO were detected in acutely inflamed and noninflamed skin. Conversely, all cAD tissues characteristically showed the most intense expression of PO in the superficial dermis. ISH showed that PO mRNA was broadly expressed in the basal epidermal keratinocytes, outer root sheath cells, and dermal fibroblasts in normal dog skin. High expression of PO mRNA was observed in fibroblasts in dog skin with chronically inflamed dermatitis. Moreover, in some chronically inflamed skin specimens, PO mRNA expression was increased in basal keratinocytes. The severity score of chronic pathological changes and CD3+ cell number in the dermis were correlated with distribution pattern of PO in the atopic skin. These data suggest that PO is able to play a role in the pathophysiology of chronic dermatitis, including cAD.\n\nChapter 2: Involvement of IL-13 in the Induction of Periostin, and Effect of Periostin on Keratinocytes\nFrom the results of Chapter 1, it was suggested that PO might be involved in the pathogenesis of chronicity in cAD. Therefore, the author tried to clarify the mechanism of the amplification and chronicity of dermal inflammation by PO in canine atopic skin in this chapter. By double-labeled ISH, IL-13 mRNA positive cells were detected near the keratinocytes and fibroblasts expressing PO mRNA in the dermis of atopic skin. TGF-β1 mRNA positive cell was not seen in all atopic skins. By in vitro assay, IL-13 induced the gene expression of PO in both canine dermal fibroblasts and keratinocytes. PO enhanced in vitro growth of canine keratinocytes. Moreover, among the PO-induced genes in cultured canine keratinocytes detected by microarray, the author identified IL-25 and KDAP as possible mediators in canine atopic skin. Also, real time PCR analysis revealed up-regulation of both IL-25 and KDAP gene expression in PO-stimulated keratinocytes. These data suggest that IL-13 possibly derived from Th2 cells stimulates PO production in both keratinocytes and fibroblasts, and then PO may play a critical role in the pathophysiology of cAD, especially in the enhancement and chronicity of skin lesion via IL-25 and KDAP.\n\nConclusion\nThe author proposed a novel hypothesis that PO induced by IL-13 contributes to the enhancement and chronicity of allergic skin inflammation in canine atopic skin. The findings of the present study provide a molecular basis for considering PO and IL-13 as a potential therapeutic targets for cAD."}]},"item_10006_description_7":{"attribute_name":"抄録","attribute_value_mlt":[{"subitem_description":"アトピー性皮膚炎（AD）は、ヒトや動物で発症する慢性アレルギー性掻痒性の皮膚疾患で、Th2型免疫反応の増強や皮膚バリアの破綻を特徴とする。ADは一度発症するとアレルゲンの侵入がなくても炎症が持続・慢性化するが、この慢性化機序の詳細は不明であり、このメカニズムの解明はADの根本的治療法開発のために重要である。\n　イヌのAD（cAD）は高い罹患率（10-15%）を示し、激しい掻痒による生活の質（QOL）の低下を引き起こすことから小動物臨床上重要な疾患である。また、cADはヒトのAD（hAD）と発症時期、病変分布およびTh2を主体とする免疫病態などの点で類似し、またイヌはヒトと生活環境を共にすることから、cADはマウスモデルでは成しえない自然発症のhADモデルとしても有用性が示されている。\n　ペリオスチン（PO）は細胞外マトリックスの一種である。POはTGF-βやIL-13により誘導され、細胞表面上のαvβ1、αvβ3およびαvβ5インテグリンに結合し、組織の発生、増殖および再構成に関与することが知られている。また、POは細胞増殖やサイトカイン誘導を介してアレルギー性炎症の慢性化機序に関与していることが示唆されており、実験的にはPO欠損マウスは野生型と比較しADや喘息といったアレルギー性の病態が軽減することが報告されている。これらはADや喘息においてPOを軸とした負の連鎖が皮膚の炎症の慢性化に大きく係わっている可能性を示唆している。しかしながら、自然発症AD症例においては、hAD患者の皮膚組織を用いたPO免疫染色と血清PO測定がPOとAD慢性化に関する数少ない先行研究であり、cADの病態におけるPOの関与については不明である。\n　そこで本研究では、POに着目してcADの慢性化機序を解明することを目的とし、第1章では健常犬およびcADを含めた皮膚疾患罹患犬の皮膚におけるPOのタンパク質の発現解析とPO産生細胞の同定を実施し、第2章ではcAD皮膚組織とイヌの培養細胞を用いてcADにおけるPO誘導因子をIL-13とTGF-β1に着目して検索した。また、POの機能的役割について、特にケラチノサイトに対する細胞増殖およびサイトカイン産生誘導性に着目して解析した。\n\n第1章：健常犬およびcADを含む皮膚疾患犬におけるPO発現解析\n　当研究室で病理検査を実施したイヌの皮膚疾患生検47例（cAD 9例、他の慢性皮膚炎32例、急性皮膚炎 2例、非炎症性皮膚疾患4例）、並びに比較対象として健常犬5例について検索した。\n\n1-1. 健常犬におけるPO発現解析\n　健常犬皮膚のPO発現パターンは、これまでの正常マウスやヒトの報告と類似していた。すなわち、免疫染色でPOタンパク質は表皮真皮境界部と毛包周囲に少量沈着し、in situハイブリダイゼーション法（ISH法）で、PO mRNAは表皮のケラチノサイト（角化細胞）、外毛根鞘細胞および真皮の線維芽細胞において発現しており、これらの細胞が健常犬におけるPO産生細胞と考えられた。また、健常犬皮膚組織を用いてPO遺伝子のTAクローニングを実施した。シークエンス解析の結果、predictedイヌPO mRNA（Accession number XM_003433308）との相同性が100%、predictedヒトPO mRNA（Accession number XM_005266231.2）との相同性が約92%であった（DDBJ accession number LC008358）。\n\n1-2. cADを含む皮膚疾患罹患犬におけるPO発現解析\n　PO免疫染色の結果、慢性皮膚炎の真皮において線維化や炎症細胞浸潤などの炎症性病変部に一致してPOが強く沈着していた。例えば、POは脂腺の破壊を特徴とする脂腺炎では毛包周囲に強く沈着し、真皮深層～皮下組織での炎症を特徴とする無菌性脂肪織炎では同部位への沈着が認められた。一方、急性皮膚炎や非炎症性皮膚疾患では健常犬と比較してPOの発現上昇は認められなかった。またcADでは他の慢性皮膚炎と比較して、真皮により強いPO沈着があり、さらに真皮表皮境界部における強い沈着が特徴的であった。また、cADにおけるPO沈着量は表皮肥厚、真皮線維化およびCD3陽性細胞浸潤数の3項目において組織学的重症度と正相関が認められた。さらにISH法により、cAD病変部の真皮線維芽細胞およびケラチノサイトにPO mRNAの発現を認め、これらがcADにおける主要PO産生細胞であることを明らかにした。\n\n　以上、正常犬および皮膚疾患罹患犬の皮膚におけるPOの局在と産生細胞、並びにcADにおける特徴的な分布パターンを明らかにした。cAD罹患犬においてPOは真皮に強く発現しており、そのPO沈着パターンは既報のhADにおけるそれと類似していた。さらに、ISH法により自然発症ADの皮膚におけるPO mRNA発現を初めて明らかにした。これまで主に培養細胞を用いた先行研究から、hADにおけるPO産生細胞は線維芽細胞と考えられていたが、cAD罹患犬においてPO mRNAはケラチノサイトにも高発現しており、またその直下におけるPO沈着が特徴的であった。これらの結果から、cADにおいてはケラチノサイトがPOの主要な産生細胞の一つであり、AD慢性化に中心的な役割を果たしている可能性が示唆された。 \n\n第2章：IL-13のPO誘導性およびPOのケラチノサイトに対する効果に関する研究\n2-1. PO誘導因子同定\n　cADの皮膚5検体を用いて、二重ISH法によりPOとIL-13/TGF-β1 mRNA発現を評価した。全例においてケラチノサイトおよび線維芽細胞にPO mRNA発現を認め、その近傍にIL-13 mRNA陽性細胞の浸潤を認めた。このIL-13 mRNA陽性細胞は真皮に浸潤する小型円形細胞であり、一部は表皮内にも浸潤していた。一方、TGF-β1 mRNA陽性細胞はcAD皮膚組織中に認められなかった。\n　二重ISH法の結果から、cADの皮膚病変におけるPOの誘導因子としてIL-13が想定されたため、健常犬皮膚から遊走法により採材し確立した培養線維芽細胞及びイヌケラチノサイト細胞株（CPEK）を用い、IL-13のPO mRNA誘導性を評価した。Real time PCR法により両細胞におけるrIL-13（50ng/μL）添加によるPO mRNA発現を評価したところ、CPEKでは添加6および24時間後、培養線維芽細胞では24時間後に、PO mRNAの発現上昇が認められた。\n\n2-2. POの機能解析\n　POのケラチノサイトに対する機能的役割について、特に増殖活性と遺伝子動態の変化に着目して検索した。\n　細胞増殖アッセイはCCK-8（同仁化学研究所、熊本）を用いて実施し、CPEKへのrPO（4µg/ml）添加24時間後に細胞増殖活性の亢進を認めた。\n　DNAマイクロアレイ法はCanine (V2) Gene Expression Microarray (4x44k, two-color array)(Agilent Technologies)を用いて実施した。CPEKへのrPO（4µg/ml）添加により発現が増加した遺伝子を網羅的に解析し、その結果IL-25およびケラチノサイト分化関連タンパク質（KDAP）を同定した(GEO Series accession number GSE77041)。マイクロアレイ法の結果を受けて、Real time PCR法を実施したところrPO（2µg/ml）添加により、CPEKにおけるIL-25およびKDAP mRNA発現量は各々36および2時間で有意に上昇した。\n\n　以上より、cADにおいては、炎症細胞が産生するIL-13が引き金となりケラチノサイト及び線維芽細胞のPO産生が亢進していることが示唆された。cADの皮膚におけるIL-13 産生細胞はその形態からT細胞、特にTh2細胞と考えられた。IL-13はADモデルマウスにおけるPO誘導因子であると報告されているが、本研究では自然発症ADの皮膚におけるIL-13とPOの関連を初めて明らかにした。\n　IL-25はTh2誘導性サイトカインの一種であり、hAD患者のケラチノサイトに高発現してフィラグリン遺伝子を減少させ、皮膚バリア機能を低下させることが知られている。本研究より、cADにおいてIL-13により誘導されたPOがケラチノサイトに作用し、IL-25を誘導することが示唆され、このIL-25を介してTh2型免疫反応増強および皮膚バリア破綻などを引き起こし、イヌAD皮膚病変を慢性化させていることが考えられた。\n　POは細胞増殖と関連する因子であることが示唆されており、PO欠損マウスはハウスダストマイトによるアレルギー刺激によっても表皮肥厚を呈さないことが報告されている。一方、KDAPは近年同定された分泌タンパク質であり、ヒトやイヌの慢性炎症の皮膚において高発現し、ケラチノサイトの分化に関連することが示唆されている。したがって本研究の結果からPOにより誘導されたKDAPがcADの皮膚における表皮肥厚と関連している可能性が示唆された。\n\n【総括】\n　本研究によりこれまで未知であったcADの慢性化メカニズムの一端が解明された。すなわち、Th2細胞より産生されたと考えられるIL-13の刺激によりケラチノサイトと線維芽細胞によるPO産生が誘導され、このPOはIL-25とKDAPという2つの因子を介してcADの皮膚病変の増悪と慢性化を引き起こしているというカスケードが示唆された。\n　現在AD症例に対する治療はグルココルチコイドなどの免疫抑制剤が主体であるが、一部のhADおよびcAD症例はステロイド抵抗性を示すことが知られている。イヌは自然発症例、細胞培養、動物実験の3側面からADの病態をとらえることができることから、AD研究の発展には比較医学である獣医学が重要な役割を担うと考えられる。本研究の結果を基盤として、今後はADモデル犬などのin vivo実験系に発展させていくことで、POやPO関連分子として同定したIL-13およびIL-25を標的としたADの新規治療法の開発が期待できると考えられた。\n\n第一章および第二章の一部は、以下の論文に公表した。\nMineshige T, Kamiie J, Sugahara G, Yasuno K, Aihara N, Kawarai S, Yamagishi K, Shirota M, Shirota K.: Expression of Periostin in Normal, Atopic, and Nonatopic Chronically Inflamed Canine Skin. Veterinary Pathology. 52: 1118-26. 2015."}]},"item_10006_dissertation_number_12":{"attribute_name":"学位授与番号","attribute_value_mlt":[{"subitem_dissertationnumber":"甲第145号"}]},"item_10006_textarea_13":{"attribute_name":"権利","attribute_value_mlt":[{"subitem_textarea_value":"本論文第一章および第二章の一部は以下のとおり公表されている。\nMineshige T, Kamiie J, Sugahara G, Yasuno K, Aihara N, Kawarai S, Yamagishi K, Shirota M, Shirota K.: Expression of Periostin in Normal, Atopic, and Nonatopic Chronically Inflamed Canine Skin. 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