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アイテム
cDNAクローニングによるシンジュガイの殻体形成に関与する遺伝子の研究
https://az.repo.nii.ac.jp/records/4166
https://az.repo.nii.ac.jp/records/4166b9fc74ff-99dc-4fc4-aa85-0164f9f84db3
| 名前 / ファイル | ライセンス | アクション |
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diss_de_kou0001.pdf (5.1 MB)
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diss_de_kou0001_jab.pdf (222.1 kB)
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| Item type | 学位論文 / Thesis or Dissertation(1) | |||||||||
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| 公開日 | 2015-05-09 | |||||||||
| タイトル | ||||||||||
| タイトル | cDNAクローニングによるシンジュガイの殻体形成に関与する遺伝子の研究 | |||||||||
| タイトル | ||||||||||
| タイトル | Studies on the genes involved in the shell formation of pearl oyster by using cDNA cloning procedure. | |||||||||
| 言語 | en | |||||||||
| 言語 | ||||||||||
| 言語 | jpn | |||||||||
| 資源タイプ | ||||||||||
| 資源タイプ | thesis | |||||||||
| 著者 |
河野, 牧子
× 河野, 牧子
× Kono, Makiko
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| 抄録 | ||||||||||
| 内容記述タイプ | Abstract | |||||||||
| 内容記述 | 炭酸塩の殻体を形成する無脊椎動物を中心とした生鉱物化 (biomineralization) は、二酸化炭素の固定化を通じた地球環境の変遷に深く係わる重要な研究領域である。軟体動物は、炭酸カルシウムを主体とした殻体を持つが、炭酸カルシウムの結晶形 (アラレ石または方解石) と殻体微細構造は、系統と密接な関係をもつ。アコヤガイ (Pinctada fucata) やシロチョウガイ (Pinctada maxima) の殻体は、2層の微細構造から成り、内側に真珠光沢のあるアラレ石結晶から成る真珠層と、外側に真珠光沢のない方解石結晶から成る稜柱層を持つ。殻体には、炭酸カルシウム以外の成分として、有機基質 (organic matrix) と呼ばれるタンパク質を中心とした有機物が含まれており、これらの成分が殻体形成を制御していると考えられている。 Miyamoto et al. (1996) は、アコヤガイの真珠中の可溶性有機基質の主成分をコードする遺伝子のcDNAクローニングによる解析から、この成分の全アミノ酸配列を決定し、ナクレイン (nacrein) と命名した。その成分は、炭酸脱水酵素 (CA:carbonic anhydrase) と相同性のあるドメインと、Gly-Xaa-Asn (Xaa=Asp, Asn or Glu) の繰り返し配列から成るドメインとから成る。このため、ナクレイン分子のCAドメインの働きにより、炭酸イオンが濃集され、他方で、Gly-Xaa-Asnの繰り返し配列ドメインの働きにより、カルシウムイオンが濃集され、炭酸カルシウムの結晶成長に結びつくと考えられた。しかし、繰り返し配列ドメインとカルシウムイオンの親和性には根拠が無く、また、ナクレインから実際に炭酸カルシウム (アラレ石) 結晶が誘導されたという報告もない。このため、ナクレインが真珠 (真珠層) の形成に不可欠な要素であるかどうかは不明である。 アコヤガイ殻体の真珠層中には、ナクレイン以外にもいくつかの成分が存在すると予想されている。このため本研究では、アコヤガイ殻体真珠層中で真珠層形成に特異的に関与するナクレイン以外の成分の同定とその構造解析を行うことを目的とした。同時に、アコヤガイと近縁種のシロチョウガイ殻体真珠層中から、アコヤガイ有機基質成分と相同の成分を同定し、両成分の構造の比較を行うことで、真珠層形成に関与する配列部分の推定を試みた。 まず、アコヤガイ殻体の真珠層と稜柱層のそれぞれからEDTAまたはアルカリを用いて有機基質を抽出し、これらの有機基質成分のSDS-PAGEから得られたバンド成分についてN末端アミノ酸配列分析を行った。その結果、真珠層と稜柱層の両層中に、ナクレインと同じ配列を持つ高分子量成分 (48 kDa) が含まれていることが分かった。一方、ナクレインとは異なるアミノ酸配列を持つ低分子量成分 (13 kDa と 16 kDa) が、真珠層のみに存在することが分かった。この成分をコードする遺伝子を、cDNAクローニングの手法で決定し、タンパク質の一次構造を推定した。この成分の分子量は約13 kDaと推定されたため、N13と命名した。N13の一次構造中には、Gly、Asn、Cysが多く、またAspとGluの酸性アミノ酸も多く含まれ、さらに、Gly-Asnから成る特異的な繰り返し配列が存在することが明らかとなった。また、カゼインキナーゼによるリン酸化モチーフやヘパリン結合モチーフに相当する配列の存在が確認された。ホモロジー検索の結果、N13と高い相同性を示す成分は存在せず、この成分は、新規のタンパク質であると考えられた。N13と比較的高い相同性を示す成分としては、塩化シアニン (Mattar, 1994 ; Scharf and Engelhard, 1993) 、真菌のマイコプラズマの Trichoderma harzianum の細胞壁タンパク質 (Lora et al., 1994) 、ウサギのケラチン (Fratini et al., 1993) 、日本住血吸虫の卵殻中のタンパク質 (Henkle et al., 1990) などが存在したが、いずれも極めて短い配列に関する相同性が認めれられただけであった。 同様の分析をシロチョウガイ殻体の真珠層についても行い、N末端のアミノ酸配列がナクレインと高い相同性を示す高分子量成分 (66 kDa) と、N13と高い相同性を示す低分子量成分 (14 kDa と 27 kDa) を発見した。後者をコードする遺伝子の同定のためにcDNAクローニングを行い、同定したクローンからタンパク質成分の一次構造を推定した。この成分の推定分子量は14 kDaであったため、N14と命名した。N14の一次構造中にもGly-Asnの繰り返し配列が存在し、アコヤガイのN13と非常に高い相同性が認められた。 以上の結果より、アコヤガイとシロチョウガイの殻体には、真珠層と稜柱層の両方に含まれるナクレインまたはナクレイン類似成分と、真珠層に特異的に含まれる低分子量成分 (N13/N14) の2種類の有機基質成分が存在することが明らかとなった。また、本研究で発見した相同のタンパク質成分 (N13/N14) の一次構造の比較から、酸性アミノ酸、リン酸化部位、Gly-Asnの繰り返し配列部分などが両成分間で非常に良く保存されていることが確認された。このため、これらの配列部分は、この成分の機能と関連した重要な部分の可能性がある。とくに、Gly-Asnの繰り返し配列は、より優れた生鉱物化能力をもつシロチョウガイに存在するN14の方でN13よりも長いことや、ナクレイン中にも類似の配列が存在することなどから、殻体形成に関連した重要な機能に係わっていると思われる。 N13やN14は、真珠層に固有の成分であるため、真珠層形成におけるイニシエーションの段階で、アラレ石の結晶核形成に関与している可能性が考えられる。一方、ナクレインは、真珠層と稜柱層の両方に含まれるため、結晶核の決定には関与せず、結晶核形成後の結晶の成長に関与しているのではないかと考えられる。 本研究より、真珠層形成に関与するN13、N14有機基質タンパク質成分が発見されたことは、真珠層形成機構、ひいては軟体動物の殻体形成機構の解明にとって重要な前進をもたらすものと考えられる。 |
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| Abstract | ||||||||||
| 内容記述タイプ | Other | |||||||||
| 内容記述 | The study of molluscan shell formation is one of the most important field of biomineralization, similar to the study of teeth or bones. Molluscan shell is classified into various types of ultrastructure, and they are composed of either aragonite or calcite, two crystal polymorphs of calcium carbonate. Shells of Pinctada fucata and Pinctada maxima, two typical species of Pteriidae, are composed of two types of shell ultrastructures, i.e., inner nacreous layer (aragonite) and outer prismatic layer (calcite). Except for calcium carbonate, molluscan shell contains a small amount of organic materials, such as proteins, sugars and lipids. They are called as organic matrix and involved in shell formation. Organic matrix is secreted from the outer epithelium, which situates underneath the shell and covers the inner organs. Considerable informations have been accumulated regarding the kinds of the organic matrix components and shell ultrastructures by biochemical analysis or microscopic observations in respect of shell formation. However, it has been generally agreeded that the structural analysis of the organic matrix components is a key for understanding the role of it related to the process of crystal growth. Recently, Miyamoto et al. (1996) clarified the complete amino acid sequence of the main component in peals of P. fucata by cDNA cloning and designated it nacrein. Analysis of the deduced amino acid sequence revealed that the protein contained two functional domains: one was a carbonic anhydrite-like domain and another was a Gly-Xaa-Asn (Xaa=Asp, Asn, or Glu) repeat domain. They suggested that nacrein actually functions as a matrix protein whose repeated Gly-Xaa-Asn domain possibly binds calcium and as carbonic anhydrates that catalyzes the HCO_3^- formation, thus participating in carbonate crystal formation of the nacreous layer. Several components except for nacrein have been estimated to present in the shell of P. fucata, and they may be essential for the formation of the shell. Therefore, the first purpose of this study is to identify and determine the structure of such a component. As the second purpose, I planned to detect homogeneous component with that in P. fucata from P. maxima, a close relation to the former. Moreover, these components must conserve some essential sequences related to shell formation regardless phylogenetic relation. To confirm this idea, the third purpose of this study is to analyze the key sequences based on the comparison of the structure of two homologous components. The AlSM were isolated by EDTA-decalcification from shells and subsequent extraction by using dilute alkali. The components in the AlSM were then analyzed on SDS-PAGE and the separated components were blotted onto the PVDF membrane to determine the N-terminal amino acid sequence. As the result, 48kDa component, which showed high similarity to nacrein in N-terminal sequence, was isolated from both the nacreous and prismatic layers. On the other hand, several components with lower molecular weights than 48kDa were isolate from both layers. The 13kDa component in these components had different N-terminal sequence from nacrein and was identified to be specific for the nacreous layer. cDNA cloning was applied to the analysis of the genes coding for the 13kDa component, and complete amino acid sequence was determined. It was designated N13 based on the estimated molecular weight of 12.5kDa. The primary structure of N13 is far separated from nacrein, containing a large amount of Gly, Asn, Cys and acidic amino acid. Moreover, a peculiar region with Gly-Asn repeat regions was detected as well as in nacrein. Homology analysis using Swissprot protein detabase clarified that the protein had no distinctive homology with the proteins ever found and determined to be new. N13 had homology to several components in its partial sequences, such as halocyanin precursor (Mattar, 1994 ; Scharf and Engelhard, 1993), cell wall protein precursor in Trichoderma harzianum (Lora et al., 1994), Gly/Tyr rich keratin precursor in rabbit hair (Fratini et al., 1993), egg shell protein precursor in Schistosoma japonicum (Henkle et al., 1990). Subsequent N-terminal amino acid analysis of the organic matrix components in the nacreous layer of P. maxima showed presence of the two components with molecular weights of 66kDa and 14kDa, which was homologyous with nacrein and N13, respectively. Therefore, I focussed on the 14kDa component, and tried to identify the genes coding for it by cDNA cloning. As a result, I succeeded to identify the gene and complete amino acid sequence. As the molecular weight of the component was estimated as 13,900Da, it was designated N14. N14 had high sequence identify with N13 of P. fucata, particularly in its Gly-Asn repeat sequences. These results indicate that shells of P. fucata and P. maxima contain two kinds of the organic matrix components, one has high molecular weight and is contained in both the nacreous and prismatic layer (nacrein), and another has low molecular weight and specific for the nacreous layer (N13/N14). Comparison of the homogeneous protein components (N13/N14) revealed that conserved sequences such as those containing acidic amino acids, phospholyration site, Gly-Asn repeat sequence was eshinated be essential related to their function. The nacreous layer specific N13/N14 components can play some important role in the nucleation of aragonite crystals at the initiation stage of shell formation. On the other hand nacrein, a common component in both the nacreous and prismatic layers may not be involved in the nucleation but in the crystal growth at the later stage of shell formation. Further analysis of the newly found organic matrix components N13 and N14 by using crystallization experiment will marks a step in the elucidation of the process of molluscan shell formation. |
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| 学位名 | ||||||||||
| 学位名 | 博士(学術) | |||||||||
| 学位授与機関 | ||||||||||
| 学位授与機関名 | 麻布大学 | |||||||||
| 学位授与年月日 | ||||||||||
| 学位授与年月日 | 1999-12-15 | |||||||||
| 学位授与番号 | ||||||||||
| 学位授与番号 | 甲第1号 | |||||||||
| 著者版フラグ | ||||||||||
| 出版タイプ | AM | |||||||||
| 出版タイプResource | http://purl.org/coar/version/c_ab4af688f83e57aa | |||||||||
