@misc{oai:az.repo.nii.ac.jp:00003845,
 author = {加川, 志津子 and Kagawa, Shizuko},
 month = {2014-04-16},
 note = {At present, the molecular biological studies were carried out on the isolates of Taylorella equigenitalis as an important pathogen for contagious equine metritis isolated in Japan and in the world.
 The study was first carried out in order to examine whether "the identical Genotype J" could be detected among the newly collected 21 isolates of T. equigenitalis isolated between 1994 and 1996 in Japan, as same as the previous study using more than one hundred isolates isolated from 1980 to 1993 reported from our laboratory (Miyazawa et al., 1995) or not. The respective pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) profiles of the 21 new Japanese isolates, as well as those of a Japanese prototype strain of EQ 59 used as a reference strain after separate digestion with the two restriction enzymes, Apa I and Not I, were essentially identical but differed from those of T. equigenitalis NCTC11184^T and Kentukcy 188.Therefore, the 21 isolates and EQ59 appeared to have a common "Genotype J". Consequently, no isolates of T. eguigenitalis with any genotype other than "Genotype J" may have reached Japan from 1980 to 1996 and the isolates with the "Genotype J" have survived in Japan since the first entry of contagious equine metritis into Japan.
 In Belgium, two genotypes were detected between two isolates, in England nine genotypes among 15 isolates, in Finland two genotypes between two isolates, in Norway one genotype among eight isolates, in France two genotypes among 10 isolates, in Sweden three genotypes among five isolates, in Switzerland three genotypes among 12 isolates and in Australia three genotypes among seven isolates.
 Two English isolates (Eng 6 and 9) and four French isolates (Fr-4, -6, -9 and -10) gave identical PFGE profiles to those of the American strain, Kentucky 188. A common genotype was also demonstrated in five isolates (Bel266-5923, Eng1, Eng2, Eng3 and N217-79) between Belgium and England, as well as a common genotype in 10 isolates (Fr-1, -2, -3, -5, -7, -8, Swi-1, -2, -3 and-6) between France and Switzerland, respectively.
 Twelve isolates obtained from male horses in France, Sweden and Switzerland demonstrated the equal availability for PFGE anlysis of genomic DNA to that of isolates from female horses. Genomic DNA from eleven streptomycin (SM)-susceptible isolates obtained in Sweden and Switzerland were classified as four genotypes by PFGE. Each of the six genotypes determined among the 11 isolates from the both countries had a single phenotype of resistance or susceptibility to SM.
 The strains used in the present study were identified as T. equigenitalis by polymerase chain reaction (PCR) using a primer pair specific for the 16SrDNA of T. equigenitalis.
 The eight strains that were classified into eight genotypes by the PFGE were chosen for the further investigations. The eight strains were classified into six to seven types by random amplified polymorphic DNA analysis (RAPD) by using different kinds of arbitrary primers. Amplified rDNA restriction analysis (ARDRA) after separate digestion with five restriction enzymes, including Alu I and Mbo I, of the 1,500 bp fragment of nearly-full length rDNA amplified by PCR did not discriminate the genomic variabilities among the eight strains of T. equiaenitalis.
 Consequently, PFGE was demonstrated to be more discriminatory than RAPD and ARDRA being proven to be unavailable, subtyping T. equigenitalic in the present study.
 Then, cloning, sequencing and characterization of nearly-full length 16S rDNA and 16S-23S rDNA internal spacer region (ISR) from isolates of T. equigenitalis were carried out in order to clarify the structure of ribosomal RNA(rrm)operon of T. equigenitalis and if these sequence informations could be applicable for molecular identification, molecular discrimination and taxonomic analysis. First, nucleotide sequencing and analysis of nearly-full length 16S rDNA from the three starains of T. eguigenitalis, namely a British type strain (NCTC11184^T), an American prototype strain (Kentucky 188) and a Japanese isolate (EQ59) following PCR amplification were performed. The primer set for 16S rDNA amplified an amlicon of about 1,500 bp in length for the all strains, respectively. Sequence differences of the nearly-full length 16S rDNA among the strains occurred at only a few nucleotide positions (nps) and therefore, an extremely high sequence similarity of the 16S rDNA was demonstrated among these three strains.
 Furthermore, the isolates of T. equigenitalis which had been isolated in Japan (n=6), Australia (n=7) and France (n=4) were subject to clone, sequence and characterize the nearly-full length 16S rDNA. The nucleotide sequence differences were demonstrated at the five loci in nearly-full length 16S rDNA among 17 isolates (EQ70～Fr-10) isolated in Japan, Australia and France, Moreover, 12 polymorphic sites occurred among 23 sequences of 16S rDNA including the three sequences examined above and the three reference sequences (X68645, AF29712, AF29713).
 Consequently, in the present study, a highly sequence similarity (99.5% or more) with the nine polymorphic sites of the 12 being from the no 138 to the total 23 sequences of 16S rDNA of T. equigenitalis.
 When a phylogenetic analysis was performed based on the sequence informations of the nearly full-length 16S rDNA of T. equigenitalis, as well as the referenced 16S rDNA sequence from some other related organisms, a close phylogenetic relationship between T. equigenitalis and T. asinigenitalis was demonstrated. Moreover, Pelistega europaea isolates newly isolated from infected respiratory tracts of pegions and Brcackiella oedipodis that cause endocarditis of cotton-topped tamarin (Saguinus oecdipus were demonstrated to belong the β-subclass as the closest neighbour of T. equigenitalis by the 16S rDNA sequence.
 In addition, the primer set for 16S-23S rDNA ISR amplified two amlicons of about 1,300 bp and 1,200 bp in length for each strain. When the two amplicons were cloned, sequenced, and compared, respectively, the ISRs were estimated to be about 920 bp in length for large ISR-A and about 830 bp for small ISR-B, in different sizes. Thus, T. equigenitalis was suggested to carry at least two rrn operons in the genome.
 Moreover, only minor sequence differences were demonstrated between the ISR-A and ISR-B from the strains of NCTC11184^T, Kentucky 188 and EQ59, respectively. A typical order of the intercistronic tRNAs with the 28 nucleotide spacer of 5'-16S rDNA-tRNA^Ile-tRNA^Ala-23S rDNA-3'was first demonstrated in the all ISRs.
 Furthermore, a similar sequence and characteristic feature of the 16S-23S rDNA ISRs from the 10 isolates of T. equigenitalis isolated in Australia (n=2), England (n=1), France (n=1), Norway (n=1) and Japan (n=5) were obtained as those of the three starains described above.
 The present results may possibly suggest that the ISRs could be similarly useful for the discrimination amongst the isolates of T. equigenitalis to the PFGE procedure, if the sequencing is employed., 本研究においてはまず最初に、当研究室からの報告(Miyazawa et al., 1995)の後、即ち1994年～1996年に日本で分離されたウマ伝染性子宮炎起因菌であるTaylorella equigenitalisの「新しい日本の分離株」21株について"ジェノタイプ J"に属するか否かを明らかに関する解析を行った。その結果、これら新しい日本のT. equigenitalis分離株21株のそれぞれのApa IとNot Iで消化後のpulsed-field gel electrophoresis(PFGE)のプロファイルは、日本の分離株であるEQ59のそれと全く同一であることが明らかとなった。また、これらはNCTC11184^T及びKentucky 188のPFGEプロファイルとは明らかに異なっていた。それ故に、これら21株とEQ59は同一の"ジェノタイプ J"に属することが明らかである。この様に、"ジェノタイプ J"は1980年～1996年に日本で分離されたT. equigenitalis株の共通した唯一のジェノタイプであることが明らかとなった。
　次に、ヨーロッパ7ヶ国と、オーストラリアで分離されたCEMの原因菌であるT. equigenitalis株74株をApa IとNot Iで消化後、PFGEの手法を用いてDNAジェノタイプ解析を行った。
　まず、外国株であるベルギー、イギリス、フィンランド、ノルウェー、フランス、スウェーデン、スイスそしてオーストラリアのウマから採取されたT. equigenitalisの分離株61株は、PFGEによって20のジェノタイプにサブタイピングされることが明らかとなった。即ち、ベルギーのウマから採取された株では、2つの分離株は2つのジェノタイプに、イギリスでは15の分離株は9つのジェノタイプに、フィンランドでは2つの分離株は2つのジェノタイプに、ノルウェーでは8つの分離株が1つのジェノタイプに、フランスでは10の分離株が2つのジェノタイプに、スゥェーデンでは5つの分離株が3つのジェノタイプに、スイスでは12の分離株が3つのジェノタイプに、そしてオーストラリアでは7つの分離株が3つのジェノタイプにそれぞれサブタイピングされた。
　2つのイギリスの分離株(Eng 6、Eng 9)と4つのフランスの分離株(Fr-4、Fr-6、Fr-9、Fr-10)はアメリカのプロトタイプ株であるKentucky188のPFGEプロファイルと同一であると判断された。この様に国を超えて存在する共通のジェノタイプに関しては、ベルギーとイングランドの間の5つの分離株(Bel266-5923、Eng 1、Eng 2、Eng 3、N217-79)、そしてフランスとスイスの間の10の分離株(Fr-1、Fr-2、Fr-3、Fr-5、Fr-7、Fr-8、Swi-1、Swi-2、Swi-3、Swi-6)でもそれぞれその存在が明らかとなった。
　更に今回はじめて、フランス、スウェーデンそしてスイスの3ヶ国の雄ウマより分離されたT. equigenitalis株12株についてPFGE解析を行ったが、CEMの雌ウマより分離されたT. equigenitalis株の場合の同様の解析と同等の有効性を示す結果が得られることが明らかとなった。また、スウェーデン及びスイスで分離されたstreptomycin(SM)感受性の11株のゲノムDNAについて、PFGEを用いた解析を行ったところ、これら2ヶ国の合計17株の6つのジェノタイプそれぞれはSM耐性かSM感受性のどちらかの単一の表現型を示すことが明らかとなった。
　なお、今回の研究で用いられたT. equigenitalis株は、T. equigenitalisの16SrDNAに特異的なプライマー対(Miserez et al., 1996)を用いたPCRによってDNAレベルでT. equigenitalisであることが同定されたものである。
　さて、PFGE法以外でも、いくつかのジェノタイピングの手法が病原細菌の株間の識別を行う上で有効であることが報告されている。そこで次に、今回の解析に用いたPFGE法が、T. equigenitalisの株間を識別する際に、他の異なる2つの代表的なジェノタイピング法、即ちrandom amplifiedpolymorphic DNA(RAPD)とamplified rDNA restriction analysis(ARDRA)に比べてより大きな識別能力を有するか否かを明らかにすることを初めて試みた。
　ゲノムDNAを、Apa IおよびNot Iを用いてそれぞれ消化後、PFGEによって8つのジェノタイプにサブタイピングされることが今回の研究で明らかとなったT. equigenitalis株の8株(NCTC11184^T、Kentucky 188、EQ59、Aus 1、Eng 10、Fr-1、Swi-5、N-187)を選んで、以下の研究を行った。まず、これら8株は、何種類かの異なるプライマーを用いて、RAPDによって、6～7つのサブタイプに分けられた。一方、PCRで増幅された、約1,500bp断片をAlu IとMbo Iを含む5種類の制限酵素をそれぞれ用いたの制限消化後のARDRAでは、これらT. equigenitalis8株のゲノムDNAレベルでの差異を識別することは出来なかった。
　この様にApa IとNot IそしてPFGEを用いた方法はT. equigenitalisの株間のサブタイピングの手法としては、RAPD法よりもすぐれていることが初めて明らかとなった。また、ARDRA法はT. equigenitalis分離株間のゲノムDNAレベルでの差異を識別する能力を有していないことが示唆された。
　次に、T. equigenitalisのrrnオペロンの構造を明らかにし、これらの配列情報が、T. equigenitalisの分子同定、分子識別及び系統分類学に有効であるか否かを明らかにするためにまず16S rDNAについて解析した。
　その結果、日本、アメリカ、イギリス、オーストラリアそしてフランスで分離されたT. equigenitalis20株での、ほぼ全長に渡る16S rDNAの決定された配列の差異はわずか8ヶ所であることが初めて明らかとなった。更に、現在までに他の研究グループによってデータベース上に公開されている3例を加えて23例の配列においてもその差異は12ケ所(99.5%以上)であった。この様な事実はT. equigenitalisの16S rDNAは極めて高い配列の類似性を特徴としていることを強く示唆している。
　近年の細菌種の分子同定の基準の1つである、16S rDNAの配列の3%以上の差異という境界値はTaylorella属の属内及び種間では適当でなく、最近報告されたCampylobacter種のいくつかに次ぐ1つの事例であることが示唆された。更に、これらT. equigenitalisの16S rDNAの配列情報を基にT. equigenitalis、T. asinigenitalisを始め、β-Proteobacteriaに属するこれらの近縁種との間での進化的距離を求め系統樹を作成した。その結果、T. equigenitalisとT. asinigenitalisに最も近縁な細菌種は、Pelistega europaeaとBrackiell oedipodisであることが明らかとなった。
　一方、NCTC11184^T、Kentucky 188そしてEQ59株をはじめ13株のT. equigenitalis株の16S-23S rDNA internal spacer region(ISR)領域をPCRで増幅し、クローニングし、シークエンシングしたところ、いずれの株においても約920塩基対のISR-Aと約830塩基対のISR-Bの2種類のISRの配列が検出された。ISR内には、ISR-A、及びISR-Bともに、いずれの株においても29塩基対をはさんでtRNA^Ile遺伝子とtRNA^Ala遺伝子がこの順番に並んでいることが明らかとなった。更に、ISR-A及びISR-Bともに、株間での配列類似性を調べた所、ISR-Aでは98.5-99.7%であり、ISR-Bでは98.9-99.9%であった。この様なISRの配列に関する結果は、T. equigenitalisのISR-A及びISR-Bの決定された塩基配列情報がT. equigenitalis株間の分子識別に有効であることを強く示唆している。

参考文献
Miyazawa, T. , Matsuda, M., Isayama, Y., Samata, T. , Ishida, Y., Ogawa, S., Takei, K., Honda, M. and Kamada, M., (1995). Genotyping of isolates of Taylorella equigenitalis from thoroughbred brood mares in Japan. Vet. Res. Commun.19, 265-271.
Miserez, R, Frey, J., Krawinkler, M. and Nicolet, J. (1996). Identifikation und diagnostik von Taylorella equigenitalis mittels einer DNA-amplifikationsmethode (PCR). Schweizer. Archiv. Tierheilkunde. 138, 115-120.},
 title = {Contagious equine metritis(ウマ伝染性子宮炎)起因菌Taylorella equigenitalisの日本及び世界の分離株を用いた分子生物学的研究},
 year = {}
}