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アイテム
海水、海泥、カキ及び海産魚類から分離したVibrio vulnificus並びにヒト臨床例由来のV. vulnificusの疫学的検討
https://az.repo.nii.ac.jp/records/3833
https://az.repo.nii.ac.jp/records/38336e1f751f-918a-41c7-993d-43e92538a3e8
| 名前 / ファイル | ライセンス | アクション |
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diss_de_otsu0019 (1.6 MB)
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diss_de_otsu0019_jab&rev (423.2 kB)
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| Item type | 学位論文 / Thesis or Dissertation(1) | |||||||||
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| 公開日 | 2014-01-10 | |||||||||
| タイトル | ||||||||||
| タイトル | 海水、海泥、カキ及び海産魚類から分離したVibrio vulnificus並びにヒト臨床例由来のV. vulnificusの疫学的検討 | |||||||||
| タイトル | ||||||||||
| タイトル | Epidemiological study of Vibrio vulnificus isolated from sea water, sea mud, oysters, marine fish, and human clinical specimens | |||||||||
| 言語 | en | |||||||||
| 言語 | ||||||||||
| 言語 | jpn | |||||||||
| 資源タイプ | ||||||||||
| 資源タイプ | thesis | |||||||||
| 著者 |
大仲, 賢二
× 大仲, 賢二
× Oonaka, Kenji
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| 抄録 | ||||||||||
| 内容記述タイプ | Abstract | |||||||||
| 内容記述 | Vibrio vulnificus（V.vulnificus）は、海水や汽水を主な生息域とする低濃度好塩性のグラム陰性桿菌である。本菌のヒトへの感染例は、1970年にRolandがヒトの下肢創傷部の皮膚滲出液から本菌分離について報告したのが最初である（Roland, F. P.: New Engl. J. Med., 282:1306, 1970）。本菌は、健康なヒトには感染しないが、肝疾患患者や免疫力の低下したヒトに感染して重篤な感染症を引き起こすことから、近年注目されている。本菌感染症は、臨床症状の違いによって、経口感染型、創傷感染型及び胃腸型の3タイプに分類されている。とくに経口感染型では、発症すると高い割合で敗血症を起し、重篤化して死亡率も高い。本菌の疫学的調査に血清学的手法や分子生物学的手法が用いられているが、詳細な報告はみられない。それ故に、本菌の感染源や感染経路については不明な点が多いのが実状である。また、薬剤感受性については、臨床治療に用いられている各種抗菌剤に対する系統的な検討は行われておらず、その耐性度も明らかにされてないのが実状である。 そこで著者は、本菌の基礎的研究の一環として、自然環境下における本菌の分布状況と汚染菌量の調査を行い、本菌が海水、海泥、カキ及び海産魚類の5.4～54.8%に分布していることを明らかにした（大仲ら：感染症誌、76、528、2002; Oonaka et al.: Jpn. J. Food Microbiol., 25、89、2008）。 本研究の概要は次のとおりである。 最初に、海水、海泥、カキ及び海産魚類から分離した株（環境由来株）とヒト臨床由来株についてShimadaらの方法（Shimada et al.: Jpn. J. Med. Sci. Biol.、37, 241, 1984）に準拠して血清型別を行い、薬剤感受性を検討した。次に、本菌の感染源や感染経路を明らかにする目的で、パルスフィールド・ゲル電気泳動（pulsed-field gel electrophoresis: PFGE）法で解析を行った。 I. 環境由来及びヒト臨床由来のV.vulnificus分離株の血清型別と薬剤感受性 本研究には、環境由来の917株及び病院から分与されたヒト臨床由来の62株のV.vulnificus、合計979株を用いた。前者の917株は、千葉県、東京都、徳島県の海水、海泥、カキ（1998年10月～2000年11月に採取、分離した）及び全国9ヵ所の海産魚類（2003年5月～2004年9月に採取、分離した）、後者のヒト臨床由来株は、全国11ヵ所及び海外で分離された株を用いた。Shimadaらの作成したV.vulnificusの血清型（O1～O18：O17、O18は欠番）を用いて血清型別を行ったところ、587株（60.0%）が13血清型に型別されたが、残りの392株（40.0%）については型別不能であった。その型別不能株について、新たにO19～O23の5つの血清型を追加作成して血清型別を行ったところ、122株がこれらの血清型に型別することができた。そして、その結果型別不能株は最終的に270株（27.6%）に減少した。 環境由来の917株では655株（71.4%）が18血清型に型別され、それらの中ではO7が371株（40.5%）と最も多く、続いてO4が58株（6.3%）、O22が45株（4.9%）、O19が37株（4.0%）であった。しかし、残り262株（28.6%）は型別不能であった。一方、ヒト臨床由来の62株では54株（87.1%）が8血清型に型別され、それらの中ではO4が27株（43.5%）と最も多く、続いてO7が8株（12.9%）、O6が7株（11.3%）、O1が5株（8.1%）で、残り8株（12.9%）は型別不能であった。この様に、血清型別に関する解析の結果、両方の由来株には共通してO7とO4が多く認められることから、両血清型と起病性との間には関連性があることが示唆される。 次に採取した地域と血清型の異なる環境由来の191株とヒト臨床由来の57株の計248株について、20薬剤を用いて薬剤感受性試験を行い、各種薬剤に対するMinimum Inhibitory Concentration（MIC）_90を検討した。環境由来株のMIC_90は、Meropenem（MEPM）とCiprofloxacin（CPFX）が各0.05μg/mlと最も抗菌力が高く、次にDoxycycline（DOXY）とMinocycline（MINO）が各0.2μg/ml、Tetracycline（TC）が0.39μg/ml、Chloramphenicol（CP）とNalidixic acid（NA）が各0.78μg/ml、Cefotaxime（CTX）及びErythromycin（EM）が各3.13μg/ml、Gentamicin（GM）が6.25μg/ml、Ampicillin（ABPC）、Cefaloridine（CER）、Cefalotin（CET）及びCefoperazone（CPZ）が各12.5μg/ml、Piperacillin（PIPC）、Cefmetazole（CMZ）、Latamoxef（LMOX）及びAmikacin（AMK）が各25μg/ml、Kanamycin（KM）が50μg/ml、Lincomycin（LCM）が100<μg/mlであった。環境由来株では、リンコマイシン系のLCMに対して耐性株が認められた。一方、ヒト臨床由来株のMIC_90はCPFXが0.05μg/mlと最も抗菌力が高く、続いてMINOが0.1μg/ml、DOXYが0.39μg/ml、TCとNAが各0.78μg/ml、EMが3.13μg/ml、GMが12.5μg/ml、CER、CET、KM及びAMKがいずれも50μg/mlであり、ABPC、PIPC、CPZ、CTX、CMZ、LMOX、MEPM及びLCMのいずれもが100<μg/mlであった。ヒト臨床由来株ではβ-ラクタム系やリンコマイシン系に対して耐性株が多く認められた。 以上の様に、ヒト臨床由来株は環境由来株に比べてβ-ラクタム系やアミノグリコシド系の薬剤に耐性傾向が高いことが明らかになった。 II. 環境由来株及びヒト臨床由来株の分子疫学的検討 分子疫学的検討は環境由来の355株とヒト臨床由来の65株の計420株について、Sfi IとNot Iを用いた無傷ゲノムDNA切断後のPFGEパターンで行った。その結果、Not Iでは312株（74.3%）で、Sfi Iでは411株（97.9%）でそれぞれPFGEパターンが得られ、Sfi Iの方がこれらV.vulnificus株の株間識別能において優れていることが明らかになった。また、DNAの切断パターンで、Not Iでは約20～600kilo base pair（kbp）の間に15本から22本のバンドが、Sfi Iでは20～500kbpの間に15本から22本のバンドがそれぞれ確認された。次に、切断が高い割合で認められた制限酵素Sfi Iで切断された411株（環境由来の349株、ヒト臨床由来の62株）のPFGE像の類似度が89%以上の場合を同一群としてUnweighted Pair-Group Method with Arithmatic mean（UPGMA）法によるクラスター解析を行った。その結果、同一群に属する環境由来株とヒト臨床由来株は少なく、18組のみが同一群に位置することが明らかになった。また、一致した18組の中で4組（22.2%）は同一血清型であったが、他の14組（77.8%）は異なる血清型であった。さらに、V.vulnificusの採取場所別に解析したところ、採取場所が同一地点であった18組中10組（55.6%）で同一血清型が認められたが、他の8組（44.4%）では異なっていた。なお、同一血清型が認められた10組中1組（10.0%）のV.vulnificusは東日本地域の海水と西日本地域のカキからそれぞれ分離されたものであった。由来別では18組中15組（83.3%）が環境由来株、2組（11.1%）がヒト臨床由来株、1組（5.6%）が環境由来株とヒト臨床由来株の両方の由来であった。 以上の様に、V.vulnificusの血清型別に関する解析で、既知の血清型に新たに筆者が追加作成した血清型を加えて検討したところ、環境由来株では71.4%が、ヒト臨床由来株では87.1%がそれぞれ血清型別されることが明らかになった。また、両由来株は共通してO7やO4に型別される菌株が多く認められ、両血清型と起病性との間に関連性があることが示唆された。 薬剤感受性試験で、ヒト臨床由来株はβ-ラクタム系やアミノグリコシド系の薬剤に対して耐性傾向にあることが明らかになった。 分子疫学的検討では、Not Iでは76.9%、Sfi Iでは97.9%の切断率がそれぞれ示され、本菌のゲノムDNAの切断にはSfi Iが優れていることが明らかになった。さらに、Sfi IによってDNA切断した菌株のPFGEの泳動像をUPGMA法でクラスター解析を行ったころ、PFGE法が本菌の分子疫学的解析に応用可能であることが示唆された。 |
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| Abstract | ||||||||||
| 内容記述タイプ | Other | |||||||||
| 内容記述 | Vibrio vulnificus (V. vulnificus) is a low-salt halophile gram-negative rod mainly inhabiting sea and estuarine water. The first reported case of human infection with this bacterium was described by Roland in 1970, in which the bacterium was isolated from skin exudate from a leg wound (Roland, F. P.: New Engl. J. Med. 282:1306, 1970). This bacterium has recently been attracting attention because it infects liver disease patients and humans with impaired immunity, but not healthy humans, and induces severe infectious disease. The disease is divided into 3 types based on the clinical symptoms: oral, wound, and gastrointestinal infection types. In the oral infection type, sepsis occurs after the onset at a high rate and aggravates, leading to a high mortality rate. Serological and molecular-biological techniques are used for epidemiological surveys of this bacterium, but there has been no detailed report. Accordingly, many points regarding the source and route of infection of this bacterium are unclear. We investigated the distribution and contamination level of this bacterium in natural environments as part of a basic study, and found that the bacterium was present in 5.4-54.8% of sea water, sea mud, oysters, and marine fish (Oonaka et al.: kansenshoshi 76:528, 2002; Oonaka et al. Jpn. J. Food Microbiol. 25:89, 2008). A summary of this study is as follows: Serotypes of strains isolated from sea water, sea mud, oysters, marine fish (environmental isolates), and human clinical isolates were determined by the method reported by Shimada et al. (Shimada et al.: Jpn. J. Med. Sci. Biol. 37:241, 1984), and drug sensitivity was investigated. To identify the source and route of infection, the isolates were analyzed by pulsed-field gel electrophoresis (PFGE). I. Drug sensitivity by serotypes of environmental and human clinical isolates of V. vulnificus This study was performed using 917 environmental and 62 human clinical isolates provided by hospitals, with a total of 979 strains of V. vulnificus. The former 917 strains were isolated from sea water, sea mud, and oysters from Chiba and Tokushima Prefectures and the Tokyo Metropolitan area (sampled and isolated in October 1998-November 2000) and marine fish from 9 regions nationwide (sampled and isolated in May 2003- September 2004). The latter were isolated in 11 regions of Japan and overseas. On serotyping following the V. vulnificus serotypes established by Shimada et al. (O1-O18 excluding missing numbers of O17 and O18), 587 isolates (60.0%) were typed into 13 serotypes, but the remaining 392 isolates (40.0%) could not be typed. When 5 new serotypes (O19-O23) were added to typing of the non-typed isolates, the 5 serotypes were identified in 122 isolates, reducing the number of non-serotype identifiable isolates to 270 (27.6%). Of the 917 environmental isolates, 655 (71.4%) were typed into 18 serotypes, and 371 were typed O7 (40.5%), the most common, followed by 58 isolates typed O4 (6.3%), 45 typed O22 (4.9%), and 37 typed O19 (4.0%). The remaining 262 isolates (28.6%) could be not be typed. Of the 62 human clinical isolates, 54 (87.1%) were typed into 8 serotypes: 27 were typed O4 (43.5%), the most common, followed by 8 isolates typed O7 (12.9%), 7 typed O6 (11.3%), and 5 typed O1 (8.1%), and the remaining 8 isolates (12.9%) could not be typed. The frequent identification of O7 and O4 was common to the environmental and clinical isolates (46.8 and 56.4%, respectively), suggesting the presence of an association between the two serotypes and pathogenicity. Drug sensitivity tests involving 20 drugs were performed in 191 environmental strains isolated from various regions and typed serotypes, and 57 human clinical isolates, with a total of 248 strains, and the minimum inhibitory concentrations (MIC)_90 of the drugs were determined. For the environmental isolates, the MIC_90 of meropenem (MEPM) and ciprofloxacin (CPFX) was 0.05 mg/ml, respectively, showing the most potent antibacterial activity, followed by 0.2 mg/ml for doxycycline (DOXY) and minocycline (MINO), 0.39 mg/ml for tetracycline (TC), 0.78 mg/ml for chloramphenicol (CP) and nalidixic acid (NA), 3.13 mg/m for cefotaxime (CTX), latamoxef (LMOX), and erythromycin (EM), 6.25 mg/ml for gentamicin (GM), 12.5 mg/ml for ampicillin (ABPC), cefaloridine (CER), cefalotin (CET), and cefoperazone (CPZ), 25 mg/ml for piperacillin (PIPC), cefmetazole (CMZ), latamoxef (LMOX), and amikacin (AMK), 50 mg/ml for knamycin (KM), and 100< mg/ml for lincomycin (LCM) . LCM resistance was noted in the environmental isolates. For the human clinical isolates, the MIC_90 of CPFX was 0.05 μg/ml, showing the most potent antibacterial activity, followed by 0.1 μg/ml for MINO, 0.39 μg/ml for DOXY, 0.78 μg/ml for TC and NA, 3.13 μg/ml for EM, 12.5 μg/ml for GM, 50 μg/ml for CER, CET, KM, and AMK, and 100< μg/ml for ABPC, PIPC, CPZ, CTX, CMZ, LMOX, MEPM, and LCM. Many human clinical isolates were resistant to β-lactams and lincomycin antibiotics. The above findings clarified that the human clinical isolates tended to be resistant to β-lactams and aminoglycosides, compared to the environmental isolates. II. Molecular-epidemiology of environmental and human clinical isolates Molecular-epidemiological analysis was performed using 355 environmental and 65 human clinical isolates, with a total of 420 isolates. The PFGE pattern after the cleavage of intact genomic DNA with Sfi I and Not I was investigated. PFGE patterns of digests with Not I and Sfi I were acquired in 312 (74.3%) and 411 (97.9%) isolates, respectively, showing that Sfi I has a more discriminating power among the V. vulnificus strains. Regarding the DNA cleavage pattern, Not I produced 15-20 bands of about 20-600 kilobase pairs (kbp), and Sfi I produced 15-22 bands of 20-500 500 kbp. After treatment with Sfi I, which cleaved the isolates at a high rate, cluster analysis of 411 isolates (349 environmental and 62 human clinical isolates) was performed using the unweighted pair-group method with arithmetic mean (UPGMA), regarding isolates with an 89% or higher similarity in the PFGE profile as belonging to one group. Only a small number of environmental and human clinical isolates belonged to the same clusters: only 18 pairs belonged to the same groups. Furthermore, only 4 of the 18 pairs (22.2%) were serotyped the same, but the serotype was different in the other 14 pairs (77.8%). When analysis was performed by V. vulnificus-sampling sites, the serotype was identical in 10 of the 18 pairs (55.6%) sampled at the same sites, but different in the other 8 pairs (44.4%). In one of the 10 pairs with identical serotypes (10.0%), one was isolated from sea water of the East Japan area and the other from oysters in the West Japan area. By the origin of isolates, 15 (83.3%) of the 18 pairs were environmental isolates, 2 (11.1%) were human clinical isolates, and one (5. 6%) was a pair of environmental and human clinical isolates. When the new serotypes were added to the analysis by serotypes, the serotype was determined in 71.4 and 87.1% of the environmental and human clinical isolates, respectively. In addition, many isolates were typed O7 and O4 in both the environmental and human clinical isolates, suggesting the presence of an association between the 2 serotypes and pathogenicity. The drug sensitivity tests clarified that the human clinical isolates tended to be resistant to β-lactams and aminoglycosides. On molecular-epidemiological analysis, the Not I and Sfi I cleavage rates were 76.9 and 97.9%, respectively, showing that Sfi I is superior regarding the genomic DNA cleavage of this bacterium. In addition, cluster analysis of the PFGE patterns of Sfi I-cleaved strains by the UPGMA method suggested that the PFGE method is applicable for molecular-epidemiological analysis of this bacterium. |
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| 学位名 | ||||||||||
| 学位名 | 博士(学術) | |||||||||
| 学位授与機関 | ||||||||||
| 学位授与機関名 | 麻布大学 | |||||||||
| 学位授与年月日 | ||||||||||
| 学位授与年月日 | 2009-02-12 | |||||||||
| 学位授与番号 | ||||||||||
| 学位授与番号 | 乙第19号 | |||||||||
| 著者版フラグ | ||||||||||
| 出版タイプ | AM | |||||||||
| 出版タイプResource | http://purl.org/coar/version/c_ab4af688f83e57aa | |||||||||
