@misc{oai:az.repo.nii.ac.jp:00003825,
 author = {大平, 猪一郎 and Ohhira, Iichiro},
 month = {2014-04-16, 2014-08-18},
 note = {Enterococcus faecalis, a bacterial strain typical of the intestinal lactic acid bacterial flora in human, has been in use since the 1950's in human and animals as a live bacterial product (probiotics) effective in regulating the intestinal function.
 E. faecalis TH10, used in this study, has been isolated as one of the dominant strains from the Malaysian fermented food "Tempeh", whose principal raw material is soybeans. The authors have so far found that, in addition to its general characteristics as E. faecalis, i.e., acid tolerance (pH 3.5), salt tolerance (10%) and bile acid tolerance (6.1%), this strain shows protease activity more than 6 times stronger than other lactic acid bacteria and production of succinic acid, used as an antibiotic and a flavor substance, and that it can be considered, therefore, to have useful probiotic characteristics.
 The objectives of this study were (1) to determine if this strain produces phenyllactic acid, a property so far unknown in other lactic acid bacteria, (2) to determine its adherence to cultured Caco-2 cells, used as a model for human intestinal epithelia cells, and (3) using molecular breeding techniques, to introduce a gene of adherence to the human intestinal cells, cloned from the genome of other lactobacilli, into this strain, in order to increase its adherence to the human intestinal cells, which is one of the most important probiotic properties, and determine if this gene is expressed in this strain.

1. Production of phenyllactic acid by E. faecalis TH10
 One of the characteristics of probiotic lactic acid bacteria is the production of antibiotic substances such as bacteriocin. As an index of its antibiotic activity against various pathogenic bacteria, the ethyl acetate extract of filtrate (pH 4.0) of MRS culture (Oxoid) of E. faecalis TH10 were screened. The ethyl acetate extract dried product showed antibiotic activity against methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA), Bacillus cereus, Escherichia coli O157:H7 and Listeria monocytogenes at a concentration of 10 mg/disc. Next, using high performance liquid chromatography with a reverse phase partition column, the antibiotic fraction was obtained from the ether extract, and after methylation of that fraction, it was analyzed by means of gas chromatography using a SPB-Octyl column (Supel) and mass spectrometry (GC/MS) and identified as phenyllactic acid, whose production has not been previously reported in lactic acid bacteria. In optical partition, using an optical isomer separation column (Nucleosil Chiral-1, Macherey-Nagel), the product was found to contain a mixture of D- and L-isomers and their concentrations in MRS broth were 13.4 μM of the D type and 6.7 μM of the L type. D- and L-phenyllactic acid (Sigma), at concentrations of 0.2%, inhibited the growth of E. coli O157:H7 in LB broth (pH 7.0) and of MRSA in MRS broth (pH 6.3) and their antibiotic activity increased with lower pH. In addition, the mixture of L- and D-types showed stronger antibiotic activity than the D-type alone. The finding of phenyllactic acid production by E. faecalis TH10 is the first such discovery in probiotic lactic acid bacteria.
 The mechanism controlling intestinal function of probiotic lactic acid bacteria is known to be associated with the pH, bacteriocin, intestinal adherence, immunology etc., but the specifics of this mechanism are hardly known. On the other hand, it is known that phenyllactic acid is produced at large quantities (6 mM) by Geotrichum candidum in the maturation process of cheese and that it is used as an antibiotic agent (bacteriostatic) against numerous infective bacteria such as L. monocytogenes and against fungi. The results obtained suggest, therefore, for the first time, that the production of phenyllactic acid by E. faecalis TH10 is one of its characteristics as a probiotic lactic acid bacterium and that the production of this substance may be associated with the intestinal controlling function of probiotics.

2. Adherence of E. faecalis TH10 to cultured Caco-2 cells as a model for human intestinal epithelial cells and to extracellular matrix proteins
 Adherence to the human intestinal cells is considered one of the most important characteristics of probiotic lactic acid bacteria. The adhesion factors of pathogenic bacteria include lectin-like proteins, lipoteichoic acid and glycoproteins, present in the fimbriae and adventitia. Glycoproteins, glucolipids and extracellular matrix (ECM) proteins present as receptors on the intestinal epithelial cells. For lactic acid bacteria, species specificity was found in the intraintestinal colonization of bacterial species and strains, and the presence of factors responsible for their specific adherence to the intestinal epithelial cells of certain species was therefore speculated, suggesting an adhesion mechanism similar to that of pathogenic bacteria. Nevertheless, the exact proteins and genes are hardly known and there are almost no reports concerning the adherence of enterococci to the intestinal cells. In this study, the adherence of E. faecalis TH10 to cultured Caco-2 cells, used as a model for human intestinal epithelia cells, and to ECM proteins, was studied.

1) Study of the adherence to Caco-2 cells using Gram staining
 A DMEM culture medium (Gibco BRL) containing antibiotics and fetal bovine serum was used for incubating the Caco-2 cells. 3.5 × 10^4 /cm^2 Caco-2 cells were seeded onto thin membrane discs (7 mm) in vials in a 24-vial plate (Sumitomo Bakelight) and cultured for 2 weeks at 37℃ and in CO_2. After the incubation, the cell layer on the disc surfaces was rinsed twice using phosphate buffer, 1 ml (5 × 10^8 CFU/ml) DMEM culture of the bacterial strains tested were added and the discs were kept for 2 hr at 37℃. The discs were rinsed twice using phosphate buffer, subjected to Gram staining and the adhered bacteria were counted.
 The number of adhered bacteria per 100 Caco-2 cells was highest for L. rhamnosus JCM 1136, so far known to have the strongest adherence, and reached 64.1 ± 12.6. The count for E. faecalis TH10, on the other hand, was 23.2 ± 6.0, a low count compared with the above. Nevertheless, the adherence of E. faecalis TH10 was higher than that of L. lactis subsp. lactis NIAI 527 (18.0 ± 4.3), previously reported by Kimoto et al. (1998) to have considerable adherence.

2) Study of the adherence to ECM proteins using Gram staining
 The ECM proteins laminin, type-I collagen, type-IV collagen, type-V collagen and bovine serum albumin (BSA) were prepared at concentrations of 2.5 pmol and fixated onto special printing glass slides (Iwaki). After blocking for 2 hr using phosphate buffer containing 2% BSA, 0.4ml of suspensions containing each of the tested bacterial strains (5 × 10^8 CFU/ml) were dripped and sensitization was conducted for 2 hr. After rinsing the slides twice using phosphate buffer containing 0.1% BSA, the adhered bacteria were subjected to Gram staining and the number of adhered bacteria was counted.
 Of the 5 strains tested, L. crispatus JCM 5810, which is known to have strong adherence to ECM proteins, showed the strongest adherence, ranging between 1,000 and 1,700 cells per 20 μm^2 of each of the tested ECM proteins. In addition, L. rhamnosus JCM 1136, which showed strong adherence to the Caco-2 cells, showed in this test low adherence of approximately 200 cells to type-I and type-V collagen. E. faecalis TH10, on the other hand, showed moderate adherence of approximately 400 cells to type-IV collagen.

3) Study of the adherence to Caco-2 cells using RI labeling
 The tested bacterial strains were incubated in MRS broth containing ^3 H-thymidine (Muromachi Pharmaceuticals), yielding RI-labeled strains, and after rinsing the radioactivity of each strain was calculated. Caco-2 cells, incubated in vials in the same manner as in 1), were rinsed, 400μl (10^7 - 10^8 CFU/ml) of suspensions of the RI-labeled tested bacterial strains were added to the cells and after incubation for 1 hr at 37℃ they were rinsed, all the Caco-2 cells contained in each vial were collected, their radioactivity was measured using a liquid scintillation counter (LSC-900, Aroka) and the number of adhered bacteria was calculated.
 The adherence of the 7 tested bacterial strains was represented by the number of bacteria adhered to all the Caco-2 cells in 1 vial (1 × 10^5 cells). The result for E. coli SH2, a bacterium containing a cilium (Fim H protein) gene which is an adhesive factor to the human intestinal cells, was 64.3 × 10^6. This value was used as 100% and the value for E. coli ORN103, from which the above-mentioned fimH gene, pSH2 was knocked out, of 9.2%, was less than 1/10 that of the new strain, representing a low value. Moreover, the adherence of 4 strains for which adherence was confirmed, such as L. lactis subsp. lactis NIAI 527, was around 40%. The adherence of E. faecalis TH10, on the other hand, was 109.7%, a value higher than that of E. coli SH2, indicating that this strain has a strong adherence.

3. Introduction of a gene of adherence to the human intestinal cells into E. faecalis TH10
 It is expected that probiotic lactic acid bacteria, which have excellent adherence to the intestinal cells, can be used for prevention of infectious diseases and for post-infectious treatment through their antagonism to the intestinal adhesion of pathogenic bacteria. The author isolated from human feces Lactobacillus fermentum FAF-1, a bacterium whose adherence is 1.48 times higher than that of E. coli SH2, cloned the gene associated with its adherence, introduced this gene into E. faecalis TH10 and determined the possibility of its expression.
 The adherence of L. fermentum FAF-1 with lectin-like protein was inferred and a forward primer (5'- CAYCARACNCAYTGGTAYATG -3') and reverse primer (5'- ARYTCDGCYTGDATCATCCA -3') were constructed from the amino acid sequence from the lectin-like protein of L. rhamnosus (Yamamoto, 1998). These are multiple primers and the Y of this primer can be C or T, R can be A or G, N can be A, C, G or T and D can be A, G or T. The genome of L. fermentum FAF-1 was PCR widened on a template and a 370 bp widened fragment was obtained. Its sequence was determined and 75.4% homology with the lectin-like protein gene of L. rhamnosus was found.
 In order to clone the above-mentioned gene, the genome library of L. fermentum FAF-1 was constructed. First, the genome was subjected to partial cleavage into 9 to 23 kb fragments by Sau 3AI and ligation to the Bam HI arm of λ DASH II, yielding the genome library. The above-mentioned 370 bp DNA sequence was used as a probe and up to 3^rd screening was conducted, and phage clone 9 with an open reading frame (ORF) of the lectin-like protein gene was obtained from the genome library. The complete sequence of the DNA integrated into this clone was determined. These results were consistent with a large cluster of 119 out of 154 amino acids from the initiation codon to the termination codon and their homology was also as high as 77.2%.
 Next, in order to sub-clone this gene of adherence to the human intestinal cells derived from L. fermentum FAF-1 in vector pIL253 for lactic acid bacteria, a forward primer (5'- GCGAATTCGTCTTCCACGACCAAGCACT -3') and a reverse primer (5'- CGCTCGAGTGGCCCTGAATCACGGTGTC -3') were designed from the sequence contained in clone 9. The PCR fragment widened from this primer was the one containing the ORF of the gene of adherence to the human intestinal cells derived from L. fermentum FAF-1. Eco RI site was set in the forward primer and Xho I site was set in the reverse primer. Both these restriction enzyme sites have cleavage parts in the multi-cloning sites of vector pIL253 for lactic acid bacteria and they were integrated into this vector at a set direction. The plasmid (p921EX) was purified and desalted, dissolved in 15 μl sterile distilled water and incorporated into E. faecalis TH10 by means of electroporation using a gene pulsar (Bio-Rad). The erythromycin (Em) resistant transforming plasmid thus obtained was found to contain a lectin-like protein gene derived from L. fermentum FAF-1, using the PCR method. The adherence to the human intestinal cells of the Em-resistant transformant of E. faecalis TH10 into which p921EX was introduced was assessed by means of the test method involving RI labeling and Caco-2 cells. The results confirmed that the transformant thus obtained had adherence 1.8 times stronger than that of E. coli SH2, which contains type-1 fimbriae. That the adherence of the transformant cures p921EX was confirmed by recovery of a value similar to that of the parent strain. In other words, the gene of adherence to the human intestinal cells of L. fermentum FAF-1 was expressed in E. faecalis TH10 and a transformant whose adherence to the intestinal cells was 1.7 times stronger than that of the parent strain. This value was used as 100%. The value for E. coli ORN 103, whose fimbriae gene was cured from E. coli SH2, was 9.2%, and less than 1/10 that of the parental strain, representing a low value.

 In this study, the probiotic characteristics of E. faecalis TH10, derived from Malaysian fermented food whose main starting material is soybeans, were studied. In addition to the general properties of E. faecalis, this bacterial strain was found to produce phenyllactic acid and to have adherence to the intestinal cells. In addition, it was found that when a gene of adherence to the human intestinal cells, derived from another lactic acid bacterium, was introduced into this strain, the gene was expressed in this strain. The result of this study is a first achievement in the field of probiotics and it is expected to lead the way to new studies involving the use of microbial genetic engineering in the field of probiotics., Enterococcus faecalisはヒトの腸内乳酸菌フローラの代表的菌種の1つであり、すでに1950年代より、その整腸作用が注目され生菌剤（プロバイオティクス）としてヒトあるいは動物に用いられたきた。
　本研究に供試したE. faecalis TH10は、マレーシアにおける大豆を主原料とする伝統的発酵食品「テンペ」から優勢菌種の1つとして分離されたもので、著者は、これまでに、本菌が酸耐性（pH3.5）、食塩耐性（10%）、胆汁酸耐性（6.1%）などE. faecalisとしての一般的性状を有するとともに、他の乳酸菌の6倍以上の強いプロテアーゼ活性を持ち、また、抗菌性物質としてのコハク酸の産生性を示すことなど、プロバイオティクスとして有用と考えられる性状を有することを明らかにしてきた。
　本研究は、さらに、本菌が (1) これまで他の乳酸菌では知られていなかった特性としてフェニル乳酸の産生性を有すること、および (2) ヒト腸管上皮細胞の培養モデルCaco-2細胞に対する付着性を有することを明らかにするとともに、(3) プロバイオティクスの最も重要な特性の1つといわれるヒト腸管付着性の増強を目的として、分子育種学的手法を用いて他の乳酸桿菌のゲノムからクローニングしたヒト腸管付着性遺伝子を本菌に導入し、その遺伝子が本菌において発現することを明らかにした。

1. E. faecalis TH10のフェニル乳酸産生性
　プロバイオティクス乳酸菌の特性の1つとして、バクテリオシンなどの抗菌性物質の産生性があげられている。そこで、各種病原性細菌に対する抗菌性を指標にE. faecalis TH10のMRS液体培地（Oxoid）培養ろ液（pH4.0）の酢酸エチル抽出物をスクリーニングした結果、酢酸エチル抽出乾燥物は10mg/ディスクの濃度でメチシリン耐性Staphylococcus aureus（MRSA）、Bacillus cereus、Escherichia coli O157:H7およびListeria monocytogenesに対して抗菌性を示すことが認められた。次いで、エーテル抽出物から逆相分配カラムを用いた高速液体クロマトグラフィーによって抗菌活性画分を得、この画分をメチル誘導体化後、SPB-Octylカラム（Supel）を用いたガスクロマトグラフィー・マススペクトロメトリーによって分析した結果、抗菌性を示す物質はこれまで乳酸菌からの産生が報告されていなかったフェニル乳酸と同定された。また、光学異性体分離用カラム（Nucleosil Chiral-1, Macherey-Nagel）を用いた光学分割によってD体とL体の混合体であることがわかり、MRS液体培地における産生量はD体13.4μM、L体6.7μMで、量比は2:1であった。D-およびL-フェニル乳酸（Sigma）は、いずれも0.2%の濃度でLB液体培地（pH7.0）においてE. coli O157:H7ならびにMRS液体培地（pH6.3）においてMRSAの増殖を抑制し、その抗菌性はpHの低下につれて増強した。また、L体とD体の混合体はD体のみより高い抗菌性を示した。このE. faecalis TH10によるフェニル乳酸の産生性は、プロバイオティクス乳酸菌における初めての知見である。
　プロバイオティクス乳酸菌の整腸作用のメカニズムについては、pH、バクテリオシン、腸管付着性、免疫などいろいろなファクターの関与が考えられているが、その詳細はほとんど不明である。一方、フェニル乳酸は、チーズの熟成過程において酵母Geotrichum candidumによって多量（6mM）に産生され、L. monocytogenesなど多くの汚染細菌に対し抗菌性物質として作用（静菌）していることが知られている。したがって、このE. faecalis TH10によって産生されるフェニル乳酸もその抗菌性を通じてプロバイオティクス乳酸菌の特性の1つとして、整腸作用に関与している可能性が初めて示唆された。

2. E. faecalis TH10のヒト腸管上皮細胞の培養モデルCaco-2細胞および細胞外マトリックスタンパク質への付着性
　プロバイオティクス乳酸菌の最も重要な特性の1つがヒト腸管付着性であるといわれている。病原性細菌の付着因子として線毛や外膜に存在するレクチン様タンパク質、リポタイコ酸、糖タンパク質などがあげられ、腸管上皮細胞側のレセプターとしては糖タンパク質、糖脂質、細胞外マトリックス（ECM）タンパク質などが明らかにされている。乳酸菌においては、菌種菌株によってその腸管内定着性に動物種特異性が見い出されていることなどから、ある種の動物の腸管上皮細胞に特異的に付着する因子が存在するものと想定されてきており、病原性細菌の場合と類似の付着機構が示されている。しかし、その明確なタンパク質や遺伝子はほとんど知られていない。特にEnterococcus属についての腸管付着性に関する報告はほとんどみられない。本研究はE. faecalis TH10 のヒト腸管上皮細胞培養モデルCaco-2細胞およびECMタンパク質への付着性について調べた。

1) グラム染色法によるCaco-2細胞への付着試験
　Caco-2細胞の培養には、抗生物質、ウシ胎児血清を含むDMEM培地（Gibco BRL）を用い、24ウェルプレート（住友ベークライト）のウェルに薄膜ディスク（7mm）を入れ、3.5×10^4個/㎝^2のCaco-2細胞を接種し、37℃で2週間CO^2培養した。培養後ディスク面の細胞層をリン酸緩衝液で2回洗浄し、供試菌株のDMEM培地懸濁液（菌体数約5×10^8/ml）1mlを注加し、37℃で2時間保持した。リン酸緩衝液で2回洗浄後、グラム染色し顕微鏡下で付着菌数を計測した。
　各供試菌株のCaco-2細胞100個当たりの付着菌数は、これまでに強い付着性を示すことが知られているLactobacillus rhamnosus JCM1136で最も高く、64.1±12.6であった。これに対してE. faecalis TH10は23.2±6.0と、前者に比して低値であった。しかし、E. faecalis TH10は、木元ら（1998）が付着性を有することを確認しているL. lactis subsp. lactis NIAI 527の18.0±4.3よりも高い値を示した。

2) グラム染色法によるECMタンパク質への付着試験
　特殊印刷のガラススライド（岩城硝子）に2.5pmolとなるようにECMタンパク質のラミニン、I型コラーゲン、IV型コラーゲン、V型コラーゲンおよび陰性対照としてウシ血清アルブミン（BSA）をそれぞれ溶解し、その一定量を一定面積に固定した。2%BSAを含むリン酸緩衝液で2時間のブロッキングの後、各供試菌の懸濁液（菌体数約5×10^8CFU/ml）0.4mlを滴下し、2時間感作した。0.1%BSAを含むリン酸緩衝液で2回洗浄後、付着した菌体をグラム染色し、付着菌数を計測した。
　供試5菌株のうち、ECMタンパク質に強い付着性を持つことが知られているL. crispatus JCM 5810は、すべての供試ECMタンパク質（20μm^2当たり）に対して1,000～1,700個の高い付着性を示した。また、Caco-2細胞に高い付着性を持つL. rhamnosus JCM 1136は、タイプIおよびタイプVコラーゲンに対して約200個の低い付着性を示すのみであった。これらに比較して、E. faecalis TH10はタイプIVコラーゲンに対して約400個の中程度の付着性を示すことが認められた。

3) RIラベル法によるCaco-2細胞への付着試験
　上記のグラム染色法は、一般に染色作業中に細胞が剥離脱落するので方法論的に難点が示唆されている。これを改善したRIラベル法によってCaco-2細胞への付着試験を行った。
　供試菌株を ^3 H-チミジン（室町製薬）添加MRS液体培地で培養しRＩラベル菌体を得て、洗浄後、1菌体当たりの放射線量を算出した。1) と同様にウェル内で培養したCaco-2細胞に、洗浄後、RIラベル供試菌懸濁液400μl（菌体数約10^7～10^8/ml）を添加し、37℃1時間接触させた後洗浄し、ウェル内のすべてのCaco-2細胞を回収して、液体シンチレーションカウンター（LSC-900, Aroka）で放射線量を測定し、付着細菌数を計測した。
　供試7菌株の付着性を1ウェルの全Caco-2細胞（細胞数約1×10^5）への付着細菌数で表示すると、ヒト腸管付着因子である線毛（Fim Hタンパク質）遺伝子を持つE. coli SH2は64.3×10^6 CFUであった。この値を100%とした場合、上記の線毛遺伝子をノックアウトしたE. coli ORN103は9.2%となり親株の1/10以下の低い値を示した。また、付着性が確認されているL. lactis subsp. lactis NIAI 527などの4株はいずれも40%前後の付着性であった。これらに対して、E. faecalis TH10は109.7%でE. coli SH2よりさらに高い値を示し、強い付着性を有することが明らかにされた。

3. E. faecalis TH10におけるヒト腸管付着遺伝子の発現
　優れた腸管付着性を持つプロバイオティクス乳酸菌は、病原性細菌の腸管付着性に拮抗し、感染症の防御ならびに感染後の治療に用いることが期待される。そこで、著者はヒトの糞便からE. coli SH2よりも1.48倍も高い付着性を有するLactobacillus fermentum FAF-1を分離しており、その付着性に関与する遺伝子をクローニングし、この遺伝子をE. faecalis TH10に導入してその発現の可能性を試みた。
　L. fermentum FAF-1の付着性はレクチン様タンパク質によるものと推測し、既知のL. rhamnosusのレクチン様タンパク質のアミノ酸シークエンス（山本、1998）からフォーワードプライマー（5'-CAYCARACNCAYTGGTAYATG-3'）とリバースプライマー（5'-ARYTCDGCYTGDATCATCCA-3'）を構築した。なお、このプライマー表記中のYは塩基のCまたはTを、RはAまたはGを、NはA、C、GまたはTを、DはA、GまたはTをそれぞれ示し、これらすべての組み合わせの複合プライマーを作製した。L. fermentum FAF-1のゲノムをテンプレートにPCR増幅して、370bpの増幅断片を得た。このシークエンスを決定したところ、L. rhamnosusのレクチン様タンパク質遺伝子と75.4%の相同性が認められた。
　上記遺伝子をクローニングするために、L. fermentum FAF-1のゲノムライブラリーを構築した。まず、ゲノムをSau 3AIで9～23kbの断片になるように限定分解し、λDASH IIのBam HIアームにライゲーションし、ゲノムライブラリーを得た。上記370bpのDNAシークエンスをプローブに3rdスクリーニングまで行い、ゲノムライブラリーよりレクチン様タンパク質遺伝子のオープンリーディングフレーム（ORF）を持つファージクローン9を得た。このクローンに組み込まれたDNAの全シークエンスを決定した。その結果、開始コドンから終止コドンまで154アミノ酸のうち119個が大きなクラスターで一致し、L. rhamnosusとの相同性は77.2%と高いものであった。
　次に、このL. fermentum FAF-1由来のヒト腸管付着性遺伝子を乳酸菌用ベクターpIL253にサブクローニングするために、ファージクローン9にに含まれるシークエンスよりフォワードプライマー（5'-GCGAATTCGTCTTCCACGACCAAGCACT-3'）とリバースプラマー（5'-CGCTCGAGTGGCCCTGAATCACGGTGTC-3'）を設計した。このプライマーにより増幅されるPCR断片は、L. fermentum FAF-1由来腸管付着性遺伝子のORFを含むものであった。フォワードプライマーにはEco RIサイトを、リバースプライマーにはXho Iサイトをそれぞれ設けた。この両制限酵素サイトは、乳酸菌用ベクターpIL253のマルチクローニングサイトに切断部位があるので、方向性を決めてこのベクターに組み込んだ。このプラスミド（p921EX）を精製・脱塩後、15μlの滅菌蒸留水に溶解し、E. faecalis TH10を受容菌としてジーンパルサー（Bio-Rad）を用いるエレクトロポレーション法に供した。得られたエリスロマイシン（Em）耐性形質転換体のプラスミドがPCR法によりL. fermentum FAF-1由来のレクチン様タンパク質遺伝子を持つことを確認し、さらに抗体を作製してこのタンパク質を検出した。p921EXを導入したE. faecalis TH10のEm耐性形質転換体のヒト腸管付着性を、RIラベル法によるCaco-2細胞を用いた試験法で評価した。その結果、得られた形質転換体は、タイプ1線毛を持つE. coli SH2に比べ1.8倍高い付着性を有することが認められた。この形質転換体の付着性はp921EXをキュアリングすることで、親株とほぼ同じ値に復帰することが確認された。すなわち、L. fermentum FAF-1のヒト腸管付着性遺伝子はE. faecalis TH10で発現され、腸管付着性が親株より1.65倍増強された形質転換体を得ることができた。

　以上、本研究は、マレーシアの大豆を主原料とする発酵食品由来のE. faecalis TH10についてプロバイオティクスとしての観点からその特性を調べ、本菌株はE. faecalisの一般的性状に加え、新たにフェニル乳酸の産生性および腸管付着性を有すること、さらに他の乳酸菌のヒト腸管付着性遺伝子を本菌に導入し、その遺伝子が本菌において発現することを明らかにしたものである。},
 title = {Enterococcus faecalis TH10のプロバイオティクスとしての特性および本菌株におけるヒト腸管付着性遺伝子の発現に関する基礎的研究},
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