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ブロモデオキシウリジン子宮内暴露の毒性学的研究 : 出生児における中枢神経系障害に起因した生殖障害
https://az.repo.nii.ac.jp/records/3819
https://az.repo.nii.ac.jp/records/381916a07909-dd3f-49a3-9189-469ceab775ad
| 名前 / ファイル | ライセンス | アクション |
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diss_dv_otsu0395 (17.3 MB)
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diss_dv_otsu0395_jab&rev (428.6 kB)
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| Item type | 学位論文 / Thesis or Dissertation(1) | |||||||
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| 公開日 | 2013-11-26 | |||||||
| タイトル | ||||||||
| タイトル | ブロモデオキシウリジン子宮内暴露の毒性学的研究 : 出生児における中枢神経系障害に起因した生殖障害 | |||||||
| 言語 | ||||||||
| 言語 | jpn | |||||||
| 資源タイプ | ||||||||
| 資源タイプ | thesis | |||||||
| 著者 |
桒形, 麻樹子
× 桒形, 麻樹子
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| 抄録 | ||||||||
| 内容記述タイプ | Abstract | |||||||
| 内容記述 | 10万種以上もある化学物質のなかには、子宮内曝露により次世代へまで重篤な生体影響を及ぼすものも少なくない。近年、子供、思春期の青年等にみられる行動の異常、記憶および学習障害などの中枢神経系障害および／または成熟後の生殖障害は、子宮内で化学物質に曝露された経歴のあることと、深いかかわりがあるのではないかと指摘されている。実際、中枢神経系障害あるいは生殖障害を誘発する化学物質は数多く存在する。しかし、子宮内で化学物質に曝露された出生児の中枢神経系障害と性成熟後の生殖障害との関連性については解明されていない。一方、5-ブロモデオキシウリジン（BrdU）は、その化学構造の特性から胎児に影響を及ぼすことが考えられ、生殖能力への影響も示唆されている（1997、1998）。BrdUは分裂中の細胞にのみ取り込まれるピリミジンアナログであり、胎児組織においても全身の分裂中細胞（DNA中）に特異的に分布する。このような特性をもつ化学物質にはアルキル化系薬物があり、細胞毒性が強いものの制癌薬などとして今日なお使用されている。また、BrdUは細胞増殖能の指標薬、変異原性試験の陽性対照薬としても用いられている。 筆者は、ラットおよびマウスの胎児が子宮内でBrdUに曝露された場合、出生後の雄動物に、交尾率の著明な低下（性成熟後）が発現することを明らかにしてきた。しかも、この雄出生児の精巣、精巣上体、前立腺、性嚢などの生殖器官に形態学的および組織学的変化は認められず、精子運動性および血中テストステロン濃度にも影響がないことを報告してきた（1997、1998）。本研究は、子宮内でBrdUに曝露された出生児に発現する中枢神経系障害と生殖障害との関連性を明らかにするために、まず、第1章ではBrdUを妊娠ラットの腹腔内に投与し、自然分娩で得られた雄出生児を用いて、脳の機能的、形態学的および神経生化学的変化の検討から、性成熟後に発現する交尾率の低下との関連を究明した。第2章は第1章で明らかにされた中枢神経障害がどのようなメカニズムで発現するかを追究した。 第1章 BrdUの投与期間および投与量はこれまでの実験の結果（1997、1998）から、妊娠ラットの9～15日に50mg/kg/dayのBrdUを腹腔内投与し、得られた雄出生児の中枢神経系障害を明らかにした。 1. 出生児の行動と機能の変化 一般に中枢神経系の障害を有する個体では、反射障害、行動の異常あるいは機能障害が認められる。子宮内でBrdUに曝露された雄出生児では、側脳室の拡張が認められたことから、中枢神経系の障害が発現している可能性が示唆された。そこで、子宮内でBrdUに曝露されたラット雄出生児を用いて、新生児期（生後6日～12日）に行動発達試験（正向反射および背地走性）を実施した。また、離乳後の生後5週～8週には、オープンフィールド、Biel型水迷路、回転ケージおよびシャトルボックス電撃回避試験を実施して、行動ならびに機能への影響を検討した。その結果、正向反射には影響は認められなかったが、背地走性において自発運動量の亢進を示唆する反応時間（手を離してから児が移動を完了するまでの時間）の短縮が生後11日以降にみられた。また、離乳後の行動試験は、回転ケージでの回転数の増加、オープンフィールドにおける移動距離の延長および立ち上がり回数の増加が観察された。また、Biel型水迷路ではゴールに到達するまでの時間の延長およびエラー数の増加が観察された。シャトルボックス電撃回避試験では、回避反応率（電撃を回避して移動した反応率）が高値を示し、試行間反応数（左右のボックス間を移動した回数）が増加した。雄の性行動観察では、マウントを示した動物数が有意に減少し、同居開始後、初回マウントが観察されるまでの時間（潜時）が延長した。これらの結果から、子宮内でBrdUに曝露されたラット出生児の行動特性として、多動（自発運動量の増加）、学習および記憶障害（特に作業記憶障害）ならびに性行動の減弱が挙げられる。この性行動の減弱が、BrdU曝露胎児の出生後に発現した交尾率の低下に深く関連していると考えられた。 2. 胎児および出生児の脳の形態学的変化 子宮内でBrdUに曝露された胎児および出生児の脳の形態学的変化を調べた結果、「大脳縦列の長さ／大脳皮質長径の長さ」が短縮し、中脳領域（前丘および後丘）が広範囲に露出していた。また大脳皮質層の菲薄化が認められたことから、BrdUの子宮内曝露は胎児および新生児の大脳皮質の発育を遅延させることが示唆された。さらに、視床下部前束部に存在し、雄の性行動を統御していると考えられている性的二型核（Sexually dimorphic nucleus of the preoptic area : SDN-POA）の体積は対照群の1/2に減少していた。側脳室の拡張は、生後21日以降の出生児に認められた。以上の結果から、BrdUの子宮内曝露は、脳の発生および分化を著しく障害することを究明した。 3. 出生児脳の神経生化学的変化 胎児がBrdUに曝露された時期は、脳の発生および分化の過程であり、この時期は神経伝達系ニューロンも同過程である。そこで出生児に発現した行動の異常の原因を探るために、性成熟後の脳内アミン濃度を測定し、神経伝達系への影響を調べた。その結果、線条体および大脳皮質前頭部におけるドパミンおよびその代謝物濃度が減少していた。ドパミンおよびセロトニン神経核が存在する中脳では、ドパミンおよびその代謝物濃度には変化が認められなかったことから、神経終末部位におけるドパミンの減少が示唆された。一方、線条体では、セロトニンおよびその代謝物濃度が増加した。神経核が存在する中脳では、セロトニン代謝物濃度が減少し代謝率が高値を示したことから、神経終末部位におけるドパミン減少に起因した代償的変化と考えられるセロトニンの過剰が示唆された。 以上のことから、子宮内BrdU曝露は、出生児の前頭部におけるドパミン伝達系の異常を誘発することが明らかとなった。 これらのことから、胎性期にBrdUに曝露された雄出生児の脳では、大脳皮質の発育不全、脳室の拡張、SDN-POAの小型化が観察された。また、機能的な変化として、自発運動量の増加、学習および記憶の障害が認められ、前頭部におけるドパミン伝達系の異常が発現していることを確認した。この雄出生児は性行動が減弱しており、このことが生殖障害を誘発させていることを立証した。 第2章 第1章の結果から、子宮内BrdU曝露により、出生児の脳では大脳皮質の発育不全、脳室の拡張およびSDN-POAの体積の減少が確認され、神経細胞の減少が示唆された。また、既報からマウスにおいてもBrdUの子宮内曝露により生殖障害が発現することは確認されている（1997）。そこで、第2章では、子宮内BrdU曝露により成熟後の出生児脳に観察された神経細胞の減少を示唆させる形態的変化が、BrdU曝露直後ではどのような変化が脳に発現してるかを明らかにするために、妊娠マウスにBrdUを単回投与し、胎児脳への形態学的変化を調べ、出生児に発現する生殖障害との関連を明らかにした。まず、交尾率の低下が発現する子宮内BrdUの曝露の臨界期を探るために、マウスの胎齢10、13あるいは15日にBrdUを単回投与した結果、胎齢10日のBrdU投与でのみ、雄出生児の交尾率の著しい低下が認められた。このように、BrdU曝露の新生児雄の交尾率低下の臨界期は胎齢10日であることを証明した。しかも、この雄出生児には、性成熟後、生殖器官の形態および精子運動性ならびに数にはBrdU曝露の影響は観察されなかったが、性行動のみが著しく減弱することを明らかにした。さらに、胎児脳における全有核細胞（以下、胎児脳細胞）中の死細胞の発現を調べたところ、マウス胎齢10日のBrdU曝露24時間後の胎児脳では過激な細胞死（アポトーシス）が観察され、生後の脳の形態異常、すなわち神経細胞の減少がBrdU曝露により強く発現していることが証明された。このアポトーシスは胎齢13あるいは15日にBrdUを曝露された胎児脳に発現したアポトーシスよりも高頻度で発現していた。また、本実験から、胎齢10日の胎児に発現した過剰なアポトーシスは終脳よりも間脳に高頻度で発現したことから、将来、視床下部を構成する部位である間脳神経細胞のBrdUに対する高感受性が考えられた。これらのことから、胎齢10日のBrdU曝露により出生児に認められた交尾率の低下は、性行動の減弱に起因した結果であり、さらにこの性行動の減弱は、胎児期の脳の過剰なアポトーシスによる中枢神経系障害に関連した変化であることを立証した。 本研究成果は、BrdUの子宮内曝露により、性成熟後、出生児に認められた生殖障害は、BrdUに対する胎児の脳細胞の高感受性によって、胎児脳細胞に発現した過剰なアポトーシスと関連のあることを立証したことにある。すなわち、胎児期の過剰なアポトーシスにより神経細胞が減少し、その結果、大脳皮質の発育不全、脳室の拡張、SDN-POAの小型化を招いたと考えられる。また、機能的な変化として、自発運動量の増加、学習および記憶の障害が認められ、この中枢神経障害としての多動が前頭部でのドパミン伝達系抑制と深くかかわっていること、さらに、この雄出生児は性行動が減弱しており、このことが生殖障害を誘発させていることを立証した。このように、子宮内でBrdUに曝露された雄出生児に、性成熟後、発現した生殖障害は、中枢神経系障害に起因した結果であると結論できる。 すなわち、本研究は、子宮内で化学物質に曝露された雄出生児に性腺障害を介さない中枢神経系障害に起因した生殖障害が存在することを体系的に明らかにしたものである。また、これまでの毒性試験は一般毒性試験や生殖毒性試験など個別に行われていたが、いくつかの組み合わせにより毒性とそのメカニズムを解明することの重要性を示唆したものである。 |
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| Abstract | ||||||||
| 内容記述タイプ | Other | |||||||
| 内容記述 | When mothers are exposed to some chemicals, the development of their children may be affected. Prenatal chemical exposure may induce behavioral abnormality, learning and memory impairment as well as reproductive dysfunction. However, there are few available data on the relationship between abnormality of the central nervous system (CNS) and reproductive dysfunction in offspring treated prenatally with a chemical. 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU), halogenated pyrimidine analog, is well known as a teratogen and it is considered that prenatal BrdU exposure affects the reproducitive function in rodents. BrdU is known to incorporate into the embryonic cellular DNA via the placenta and to alter the differentiation during development. Alkylating anticancer agents, which have similar characteristics to BrdU, are still being used in the clinical field although they show severe cytotoxicity. BrdU has also been used as a test drug for cell proliferation or a positive control as a carcinogenic toxicant. We have reported that prenatal BrdU exposure decreased the copulation rate in male rats and mice though there were no histopathological changes in the testes, epididymides, prostate, or seminal vesicle, or changes in sperm motion and plasma testosterone concentration. In this study, in order to address the relationship between an abnormal CNS and reproductive dysfunction in males treated prenatally with BrdU, the effect of prenatal exposure on the CNS was examined functionally, morphologically and neurochemically. Subsequently, the mechanism of altered CNS functions induced by prenatal BrdU exposure was investigated. Chapter 1 The effects of prenatal BrdU exposure on the CNS were examined. BrdU at a dose of 50 mg/kg/day was administered intraperitoneally to pregnant rats on gestational days 9 though 15 (plug day = gestational day 0) based on the results of our previous studies. Treated dams were allowed to deliver naturally and male offspring were obtained. 1. Effects of prenatal BrdU exposure on behavior In general, reflex or behavioral alterations can be detected in cases in which the CNS is damaged. Thus, it is reasonable to consider that prenatal BrdU exposure affects the CNS, because male rats and mice treated prenatally with BrdU showed dilatation of the lateral ventricles after puberty. Male rats treated prenatally with BrdU were subjected to a variety of pre- and postweaning behavioral tests: surface righting, negative geotaxis, open field test, Biel maze test, wheel cage test, and shuttlebox avoidance test. Male rats treated prenatally with BrdU showed accelerated negative geotaxis and increased ambulation and rearing in the open field as well as a higher activity in wheel cage. In the Biel maze, male rats treated prenatally with BrdU showed prolonged swimming time to reach the goal and an increase in the number of errors. In the shuttlebox avoidance response, increases in the avoidance rate and intertribal response were observed. In addition, the number of males mounting was decreased and the latency of the first mount was extended in the masculine sexual behavior. Taken together, male rats treated with BrdU showed hyperactivity, learning and memory impairment, and poor masculine sexual behavior, resulting in a decrease of the copulation index. 2. Effects of prenatal BrdU exposure on brain development The developmental effects of prenatal BrdU exposure on the brain were investigated in male rats. Prenatal BrdU exposure induced abnormal brain development. The ratio of the length of the longitudinal fissure to that of the cerebral cortex was decreased, and the colliculus of the anterior and posterior midbrain was seen clearly in the embryonic period and thereafter. The cerebral cortex layer was thinner, suggesting that prenatal BrdU exposure induced cerebral development retardation at the prenatal and postnatal stages. The volume of the sexually dimorphic nucleus of the preoptic area (SDN-POA), which is considered to regulate masculine reproductive behavior in rats, was decreased in rats treated prenatally with BrdU. The ratio (the volume of the SDN-POA/ whole brain weight) in BrdU-treated males was 48.7% of that of the controls. These results suggested that prenatal BrdU exposure affected brain development. 3. Neurochemical effects of prenatal BrdU exposure on the brain The administration period of BrdU in this study corresponded to the development and differentiation stage of the brain in rats. The system of neurotransmission was also developing during this period. To clarify the characteristics of abnormal behavior in male rats treated prenatally with BrdU, the levels of monoamines such as dopamine(DA), serotonin(5-HT) and their metabolites (dihydroxyphenylacetic acid; DOPAC, homovanilic acid; HVA, 5-hydroxy-3-indolacetic acid; 5-HIAA) in the brain were determined and the neurochemical effects of prenatal BrdU exposure on the brain were evaluated. A tendency toward decreased DA content in the frontal cortex, a significant decrease in DA and their metabolites, DOPAC and HVA in the striatum were found without DA turnover (DOPAC+HVA/DA) in male rats treated prenatally with BrdU. In contrast, increases in 5-HT and 5-HIAA and a decrease in 5-HT turnover (5-HIAA/5-HT) were found in the striatum, suggesting a functional disturbance in this area. In the midbrain, including the substantia nigra, ventral tegmental area and raphe nuclei, which are the main DA and 5-HT cell bodies, DA, DOPAC and 5-HT levels, and DA and 5-HT turnover were not changed except for a decrease in 5-HIAA levels. Taken together, a compensatory hyperinnervation of the 5-HT neurons occurred during DA denervation in the striatum and the dopaminergic system is affected by prenatal exposure to BrdU in its terminal areas, mainly in the striatum. These results demonstrated that male rats treated parentally with BrdU showed retarded cerebral development, dilatation of the lateral ventricles, and reduction of SDN-POA volume. As functional disturbances, they showed hyperactivity, and learning and memory impairment. In addition, the dopaminergic system was affected by prenatal exposure to BrdU in its terminal areas, mainly in the striatum. Male rats treated prenatally with BrdU showed impairment of masculine sexual behavior, resulting in decreased copulation rate. Chapter 2. Prenatal BrdU exposure induced the retardation of cerebral development, dilatation of the lateral ventricles, and a decrease in SDN-POA volume, suggesting a decrease in the number of neural cells in rats treated prenatally with BrdU. Prenatal BrdU exposure induced the same reproductive dysfunction in mice as observed in rats. In this chapter, to examine fetal brain damage after BrdU exposure, a single administration of BrdU was given to pregnant mice intraperitoneally and the embryos were obtained 24 hours after treatment. The relationship between fetal brain damage and postpubertal reproductive dysfunction was then clarified. Firstly, to determine the critical period of decrease in the copulation rate in mice treated prenatally with BrdU, pregnant mice were treated intraperitoneally with BrdU at 200 mg/kg on days 10, 13 or 15 of gestation or with BrdU at various doses (100 to 800 mg/kg). Dams were allowed to give birth and male offspring were obtained. The copulation rate in males treated prenatally with BrdU on day 10 of gestation was significantly decreased, while the rate in groups treated on days 13 or 15 of gestation was comparable to the control level, indicating that the critical period of decrease in the copulation rate induced by prenatal BrdU exposure in mice offspring was day 10 of gestation. In a dose-dependency study, the copulation rates in groups treated with BrdU at 200 mg/kg and over were decreased. Neither histopathological changes of the testes and sex-accessory glands nor alterations in sperm motility and concentration were observed in mice treated with BrdU at 800 mg/kg on day 10 of gestation. However, masculine sexual behavior was markedly impaired in this group. In addition, mouse embryos 24 hours after a single treatment of the dams with BrdU on day 10 of gestation showed excessive cell death (apoptosis) in the embryonic brain (embryonic brain; all cells composed neural tube on days 11 to 16 of gestation), suggesting that prenatal BrdU exposure decreased the number of neural cells, and induced postnatal morphological changes in the brain. The incidence of cell death was higher in fetuses 24 hours after treatment on day 10 of gestation than those treated on days 13 or 15 of gestation. The incidence of cell death in the ependymal and mantle layers of diencephalon was higher than that in the ventricular zone of the telencephalon, suggesting that neural cells in the diencephalons which compose the hypothalamus during development, show a high vulnerability to BrdU damage. From these results, it is concluded that the decrease in the copulation rate in mice treated with BrdU on day 10 of gestation was related to poor masculine sexual behavior, and damage to the CNS resulting from excessive cell death (apoptosis) may lead to reproductive dysfunction after puberty. In this study, it was demonstrated that the reproductive dysfunction induced by prenatal BrdU exposure resulted from the high susceptibility of embryonic neural cells (all cells composed nural tube), and this susceptibility resulted in excessive cell death (apoptosis). BrdU induced excessive embryonic neural cell death, and a decrease in the number of neural cells. Offspring showed developmental retardation of the cerebrum, dilatation of the lateral ventricles, and a decreased the SDN-POA volume. Rats treated prenatally with BrdU also showed hyperactivity, and learning and memory impairment. Prenatal BrdU exposure also induced functional disturbance in the DA-terminal area, especially in the stiratum, suggesting that this neuochemical dysfunction was related to hyperactivity. In addition, male rats treated prenatally with BrdU showed impaired masculine sexual behavior, which resulted in reproductive dysfunction. These results indicated that reproductive dysfunction in males treated prenatally with BrdU was induced by damage to the CNS. In conclusion, it was confirmed that reproductive dysfunction in males exposed prenatally to an agent resulted from damage to the CNS, not mediated by testicular toxicity. |
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| 学位名 | ||||||||
| 学位名 | 博士(獣医学) | |||||||
| 学位授与機関 | ||||||||
| 学位授与機関名 | 麻布大学 | |||||||
| 学位授与年月日 | ||||||||
| 学位授与年月日 | 2002-05-27 | |||||||
| 学位授与番号 | ||||||||
| 学位授与番号 | 乙第395号 | |||||||
| 著者版フラグ | ||||||||
| 出版タイプ | AM | |||||||
| 出版タイプResource | http://purl.org/coar/version/c_ab4af688f83e57aa | |||||||
