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Anisakis simplexの同胞種およびヒト感染虫体における主要抗原の分子生物学的解析
https://az.repo.nii.ac.jp/records/3296
https://az.repo.nii.ac.jp/records/3296c4446e47-8e01-47e9-8d42-cf3cce298e50
| 名前 / ファイル | ライセンス | アクション |
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diss_de_kou0018 (5.3 MB)
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diss_de_kou0018_jab&rev (336.8 kB)
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| Item type | 学位論文 / Thesis or Dissertation(1) | |||||||||
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| 公開日 | 2013-02-21 | |||||||||
| タイトル | ||||||||||
| タイトル | Anisakis simplexの同胞種およびヒト感染虫体における主要抗原の分子生物学的解析 | |||||||||
| タイトル | ||||||||||
| タイトル | Molecular identification of sibling species of A. simplex (Nematoda: Anisakidae) and characterization of their major antigen | |||||||||
| 言語 | en | |||||||||
| 言語 | ||||||||||
| 言語 | eng | |||||||||
| 資源タイプ | ||||||||||
| 資源タイプ | thesis | |||||||||
| 著者 |
梅原, 梓里
× 梅原, 梓里
× Umehara, Azusa
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| 抄録 | ||||||||||
| 内容記述タイプ | Abstract | |||||||||
| 内容記述 | アニサキス亜科線虫はタラ・サバ・イカなどの海産魚介類を運搬宿主とし、これらを捕食するイルカ・クジラなどの海獣類を終宿主とする寄生性の線虫である。ヒトが同線虫の幼虫を宿した魚介類を生食した場合、幼虫に感染しアニサキス症を発症する。わが国では魚介類を生食する習慣があることから、本症の発生率は非常に高く、年間2000例から3000例に上ると推定されている。本症の原因となるアニサキス亜科の幼線虫については複数種が報告されているが、最も感染例が多いのは、Anisakis simplexである。A. simplexは形態学的に単一種とみなされていたが、近年、リボソームRNA遺伝子の塩基配列の相違から、同胞種(生殖的に隔離されており、同所的に生息するが、形態的にはほとんど区別できない近縁種の一群)として、A. simplex sensu stricto、A. pegreffiiおよびA. simplex Cの3種に分類されている。このような背景から、A. simplex同胞種に関する研究は、人獣共通感染症の疫学的研究として、大変重要であると考えられている。そこで、本研究では、(1)日本近海におけるA. simplex同胞種の地理的分布を調査すること、(2)A. simplex同胞種のヒトへの感染状況を明らかにすること、更に(3)アニサキス主要抗原として報告されているAni s 1抗原について同胞種間で比較検討することを目的とした。 第1章 日本近海におけるA. simplex同胞種の地理的分布 A. simplex幼虫および成虫は、日本近海の広範囲な地域に生息する魚類、海棲哺乳類から見出されているが、本種の同胞種の詳細な地理的分布は明らかでない。そこで本章では、まず、日本近海産の魚類および北西北太平洋産のミンククジラより採取したA. simplexの幼成虫151虫体について、PCR-RFLP解析を行い、同胞種の同定を試みた。各虫体よりゲノムDNAを抽出し、ユニバーサルプライマーを用いてリボソームRNA遺伝子の5.8Sを含むITS領域をPCR法で増幅し、制限酵素Hinf IおよびHha Iによって処理した。その結果、制限酵素の切断パターンに基づきA. simplex s. str.、A. pegreffiiおよび両同胞種の交雑型を同定した。そこで、A. simplex s. str.および、A. pegreffiiについて、18Sから28SリボソームRNA遺伝子の塩基配列を決定し、同胞種間における変異の程度を検討したところ、1353塩基中わずか2塩基のみの変異であり、相同性は99.9％であることを明らかにした。一方、各同胞種の地理的分布について解析を行ったところ、北海道近海および北西北太平洋の幼成虫110虫体はA. simplex s. str.、福岡県近海の幼虫37虫体はA. pegreffiiであり、両同胞種の混合感染は認められなかった。また、北西北太平洋の成虫3虫体と福岡県近海の幼虫1虫体は交雑型であった。これより、日本近海においてA. simplex s. str.は北太平洋、A. pegreffiiは日本海南部に分布し、両同胞種は側所性(2種が異なった地理的領域を占めるが、それらが互いに隣接して存在する状態)の分布傾向にあることを明らかにした。 第2章 日本におけるA. simplex同胞種のヒトへの感染状況 日本近海においてA. simplex s. str.は北方域、A. pegreffiiは南方域に分布していたことから、両同胞種のヒトへの感染の可能性が考えられる。しかしながら、アニサキス症患者より摘出された幼虫体を同胞種として同定した報告はわずかであり、同胞種のヒトへの感染状況は解明されていない。そこで本章では、北海道および九州地方のアニサキス症患者85名より摘出された幼虫100虫体を用い、PCR-RFLP解析により同胞種の同定を試みた。その結果、84名の患者(98.8％)は、A. simplex s. str.に感染し、九州地方の男性患者1名のみA. pegreffiiに感染していた。 わが国のアニサキス症は、北海道から沖縄まで全国的に多数の患者発生があると報告されているが、北海道ならびに九州地方といった新鮮な魚介類が手に入る沿岸地域では極めて頻度は高い。よって、本研究により日本におけるアニサキス症の主要病原虫は、A. simplex s. str.であることが明らかとなった。また、臨床検体の同胞種の同定は、予防医学の面からも大変重要であることを裏付けた。 第3章 同胞種間におけるアニサキス主要抗原Ani s 1の比較検討 アニサキス症は初感染の場合、経口摂取された幼虫が消化管粘膜に刺入すると異物肉芽腫ないし粘膜下腫瘍を形成する。しかし、あらかじめ感作を受けた患者の場合、アニサキス抗原に対して即時型アレルギー反応を生じ、急性腹症を発症する。このように、本症はアレルギー症であることから、適切な補助診断法として血清免疫学的診断法の開発が進められてきた。そして、近年本虫の主要抗原としてAni s 1が同定されている。そこで本章では、ヒト感染例が確認されたA. simplex s. str.およびA. pegreffiiのAni s 1抗原について比較検討を行った。まず、公開されているAni s 1抗原のcDNA配列情報をもとに2組のプライマーを設計し、RT-Nested PCRを行った。得られたORF領域の増幅産物はクローニングし、塩基配列を決定した。クローニングしたORFのcDNAは、194アミノ酸をコードし、分子量約19KDaと推定された。また、モチーフ配列よりKunitz型トリプシンインヒビターに属すると考えられた。A. simplex s. str.とA. pegreffiiのアミノ酸配列を比較した結果、成熟タンパク質の配列内に5ヶ所のアミノ酸置換を見出した。 次に、5ケ所のアミノ酸置換と抗原性の関係を検討するため、大腸菌発現ベクターにシグナルペプチド領域を切除したORFのcDNAをサブクローニングし、発現・抽出・精製した組換えタンパク質は、A. simplex s. str.を実験的に感染させたラット血清による免疫ブロッティングに用いた。その結果、各同胞種のcDNAより合成した組換えタンパク質に対して抗A. simplex s. str.ラット血清の陽性反応が認められた。しかしながら、ラット抗血清について両同胞種の各組換え抗原で吸収試験を行ったところ、A. simplex s. str.の組換え抗原によって吸収した血清は完全な吸収効果を示し、両同胞種の組換えAni s 1に全く反応を示さなかった。一方、A. pegreffiiの組換え抗原によって吸収した血清は、部分的な吸収効果しか示さず、A. pegreffiiの組換えAni s 1には全く反応を示さなかったが、A. simplex s. str.の組換えAni s 1に対しては反応が認められた。このことから、Ani s 1の抗原多型を応用することで、アニサキス症のより正確な血清診断および原因虫体の同定が可能となった。 海に囲まれ、魚介類を生食する習慣を持つわが国では、従来からアニサキスの研究が進展してきたが、これまでA. simplexの同胞種に関する報告はほとんどなかった。更に臨床検体の同胞種の同定については、世界でもわずかな報告しかされていない。本研究は、日本におけるA. simplex同胞種の分布とアニサキス症の主要病原虫を明らかにした初めての報告であり、これらの成果はわが国のアニサキス症予防対策を考える上で重要である。また、アレルゲンとなるタンパク質をコードするcDNA塩基配列の解析により、抗原タンパク質のアミノ酸配列に同胞種間での変異を見出した。本研究で得られた研究成果は、アニサキス症の血清診断法を確立する上で、大変重要な知見である。 |
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| Abstract | ||||||||||
| 内容記述タイプ | Other | |||||||||
| 内容記述 | Parasites morphologically consistent with Anisakis simplex sensu lato collected from the coast of Japan and Western North Pacific Ocean were examined by PCR-RFLP and sequence analysis of the ITS region (ITS1, 5.8S rRNA gene and ITS2). Based on the RFLP patterns generated by HinfI and HhaI and the sequence differences of the ITS region, A. simplex s. str., A. pegreffii and a hybrid genotype were identified. Furthermore, this study revealed that A. simplex s. str. is primarily distributed in the North Pacific Ocean and A. pegreffii is primarily distributed in the southern Sea of Japan. Therefore, I have also attempted to identify major etiological agent of anisakiasis in Hokkaido and Kyushu by PCR-RFLP analysis. Interestingly, although I detected numerous larvae of A. pegreffii in commercial fishes in Kyushu, five out of five patients in Hokkaido and seventy nine out of eighty patients in Kyushu infected with only A. simplex s. str. On the other hand, one patient in Kyushu infected with only A. pegreffii. To compare major allergen of A. simplex (Ani s 1) between A. simplex s. str. and A. pegreffii, I cloned, sequenced, and obtained recombinant Ani s 1 of two sibling species. Examination of the motif search results of Ani s 1 ORF region defined the Kunitz-type trypsin inhibitor motif. Alignment of amino acid sequences of Ani s 1 between A. simplex s. str. and A. pegreffii revealed the presence five residue substitutions in the mature protein sequence. When analyzed antigenicity of recombinant Ani s 1 proteins between two sibling species by immunoblotting, the polyclonal antiserum from rat experimentally infected with A. simplex s. str. reacted positively to recombinant Ani s 1 proteins of two sibling species. However, preabsorption experiments revealed that the specificity of the polyclonal antiserum to Ani s 1 from A. simplex s. str. These results permit accurate diagnosis and identification of pathogen at the sibling species level by immunoblot assay. |
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| 学位名 | ||||||||||
| 学位名 | 博士(学術） | |||||||||
| 学位授与機関 | ||||||||||
| 学位授与機関名 | 麻布大学 | |||||||||
| 学位授与年月日 | ||||||||||
| 学位授与年月日 | 2007-03-15 | |||||||||
| 学位授与番号 | ||||||||||
| 学位授与番号 | 甲第18号 | |||||||||
| 著者版フラグ | ||||||||||
| 出版タイプ | AM | |||||||||
| 出版タイプResource | http://purl.org/coar/version/c_ab4af688f83e57aa | |||||||||
