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アイテム
微小管結合タンパク質タウの構造と発現を解析するためのアイソフォーム特異的な検出法および定量法に関する基礎的研究
https://az.repo.nii.ac.jp/records/3295
https://az.repo.nii.ac.jp/records/3295a2ada638-a6fd-4a7d-9d5e-6153668deb84
| 名前 / ファイル | ライセンス | アクション |
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diss_de_kou0016 (11.9 MB)
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diss_de_kou0016_jab&rev (412.9 kB)
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| Item type | 学位論文 / Thesis or Dissertation(1) | |||||||||
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| 公開日 | 2013-02-21 | |||||||||
| タイトル | ||||||||||
| タイトル | 微小管結合タンパク質タウの構造と発現を解析するためのアイソフォーム特異的な検出法および定量法に関する基礎的研究 | |||||||||
| タイトル | ||||||||||
| タイトル | Novel techniques for analyzing the expression of two isoform-groups derived from the gene encoding the microtubule-associated protein tau and a tertiary structure of the gene products | |||||||||
| 言語 | en | |||||||||
| 言語 | ||||||||||
| 言語 | eng | |||||||||
| 資源タイプ | ||||||||||
| 資源タイプ | thesis | |||||||||
| 著者 |
上野, 瞳
× 上野, 瞳
× Ueno, Hitomi
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| 抄録 | ||||||||||
| 内容記述タイプ | Abstract | |||||||||
| 内容記述 | 神経原線維変化は、過剰なリン酸化によって微小管から遊離したタウの細胞内蓄積が原因となって脳内の神経細胞に認められ、この病変が進行すると神経細胞死を引き起こすと考えられている。「Front temporal dementia with parkinsonism linked to chromosome 17(FTDP-17)」に、タウ遺伝子の家族性変異が同定されたことから、認知症を伴う神経変性疾患の発症においてこのタウが重要な役割を担うと考えられる様になった。 一方、ヒト脳において、タウは選択的スプライシングにより6つのアイソフォームとして発現しており、反復配列の数により3リピートタ(3Rtau)と4リピートタウ(4Rtau)の2つのグループに分けられる。ヒトの初期発生では3Rtauが選択的に発現し、成長に伴い6つのアイソフォーム全てが発現するようになる。また、神経原線維変化を伴う疾患ごとに、蓄積するアイソフォームの種類が異なっている。すなわち、生理的あるいは病理学的に異なる役割を各アイソフォームが持っている可能性がある。そこで、筆者は3Rtauと4Rtauを高い特異性で分子識別できる方法、あるいは高感度に定量する方法を確立し、これらを用いてタウの生化学的特徴や発現量について検討することを目的として本研究を開始した。 まず、合成ペプチドを免疫原としてポリクローナル抗体、3リピート特異的抗体(T3R)と4リピート特異的抗体(T4R)を作製した。使用した合成ペプチドは、βシート構造のコア配列(PHF6モチーフ)が含まれるようにデザインしたものである。作製した抗体は、3Rtauおよび4Rtauそれぞれに高い特異性を示すだけでなく、βシート構造が形成されるとタウに対する結合活性が低下する特徴を持っていた。これら2つの抗体が認識する配列は、合成ペプチドの配列と矛盾なく微小管結合部位内の局所に限定された。このことから、各抗体を用いて3リピートおよび4リピートそれぞれの局所における構造変化を特異的に検出することができると考えた。それ故に、この局所の構造変化は、おそらくタウタンパク質全体の構造変化に先行して起こる変化と考えられる。 次に、タウタンパク質の微小管結合領域からC末端にかけて段階的に欠失させた変異体を作製し、T3RとT4Rのこれら変異体に対する結合親和性について検討した。その結果、前述したPHF6モチーフよりC末端側を欠失させた変異体に対するT3RとT4Rの結合親和性は、野生型の全長タウタンパク質に対する親和性に比べて高くなり、特に驚くべきことにPHF6モチーフ直後からC末端までの全配列を欠失した変異体に対して最も高い結合親和性が観察された。このことは、T3RとT4Rの認識配列の高次構造がC末端側の領域に依存していることを強く示唆している。更に、組換えタンパク質を用いた自己会合実験を行ったところ、C末端欠失変異体ではβシート構造形成のレベルが野生型の全長タウと比べて低下していた。この結果は、βシート構造の形成と共にT3RとT4Rのタウへの結合が抑制されることと矛盾しない。神経原線維変化に見られるタウの凝集とβシート構造の形成が密接に関連していることを考慮すると、T3RとT4Rがタウの凝集過程を詳細に観察する上で有用なプローブとして、タウの生化学的あるいは病理組織学的解析への利用が可能である。また、T4Rは3RtauのC末端欠失変異体に結合するが、一方、T3Rによる4RtauC末端欠失変異体に対する結合活性はT4Rの場合と比べ非常に低いものであった。このことは、3Rtauと4RtauのPHF6モチーフを含む領域の構造が、異なっていることを示唆するものであり、タウの凝集メカニズムを解明する上で興味深い結果である。 脳神経系の神経細胞で発現しているタウタンパク質の量は、主に翻訳後の修飾と代謝に依存しているとする考えが従来一般的に受け入れられてきた。しかし、翻訳後修飾や代謝に関する研究に比べて、転写のレベルにおける発現量の調節に関する研究は進んでいない。そこで、次に筆者はタウ遺伝子の転写レベルでの発現調節をアイソフォームごとに検討することを目的とした定量法の確立のための研究を行った。 PCR法を応用した3Rtau及び4RtauのmRNAの定量法がすでに2つのグループから報告されているが、各アイソフォームに対する特異性及び感度の少なくともいずれかについて、より詳細な検討が必要である。そこで、各アイソフォームに対するPCR増幅反応の特異性がより高くなるように検討した上で、これまでに報告されていない特異的なPCRプライマーセットを決定し(特許出願済)、TaqManプローブによって増幅DNA断片を検出するリアルタイムPCR法による3Rtau及び4Rtau mRNA量の高感度定量法を確立した。その結果、定量に影響を及ぼす非標的配列の増幅をほぼバックグラウンドレベルに押さえることができ、従来のリアルタイムPCR法と比べ、本定量法の検出感度は10～100倍であった。この様な特異性および感度については、培養細胞(COS7細胞、SH-SY5Y細胞)に強制発現させた各アイソフォームのmRNAを用いて検討した。また、定量結果の精度をより高くするために、本定量法における検量線の作成には、各アイソフォームの標的領域に対するキャップ構造のついたcRNAを利用するように条件を決定した。本法の各アイソフォームに対する特異性を確認するために、ヒト胎児および成人の脳由来の全RNA(Biochain社製)を鋳型として用いて定量を試みたところ、胎児においては3Rtauのみが、成人においては3Rtauおよび4Rtauの両者のmRNAが検出され、これまでにノーザンブロット法等で得られた結果と一致するものであった。ただし、成人における両アイソフォームmRNAの量比は1:1であるとされてきたが、本定量法を用いた結果では約2:3の割合で4Rtauの方が多く発現していることを示す結果となった。これは、特異性および感度が大幅に改良された本法を用いて初めて得られた結果であるが、今後本法を用いて多くの検体を対象とすることで各アイソフォームmRNA量の差異を明らかにすることができると考えている。更に、本法を用いてアルツハイマー病患者の脳由来の全RNA中に含まれる各アイソフォームmRNAの量比を調べたところ、患者と健常者とでは異なっており、3Rtauの転写量の割合が増加していることを示す結果が得られた。これは認知症発症メカニズムを解明する上で大変に興味深い結果であり、従来考えられてきた発症メカニズムにアイソフォームmRNA量の調節メカニズムを加えた新たな仮説を提示することができるものと考える。 更に、単一あるいは数個の細胞を標的として、各アイソフォームmRNA量を上述の方法によって定量的に検出することが可能かどうかを検討した。マウス脳の凍結ブロックより切り出した40μm厚の切片をレーザーマイクロダイセクション(LMD)用スライドグラスに固定しトルイジンブルーで染色した。LMD装置(Leica社)を用いて、海馬錐体細胞をCA1、CA2およびCA3領域からそれぞれ約20～30個の細胞に相当する部分を切り出し、全RNAを抽出した。この全RNAを鋳型として検討した結果、2～5個程度の細胞に由来する全RNAを鋳型として各アイソフォームmRNA量を定量することが可能であることが確認された。そして、CA1、CA2およびCA3領域間の4RtauのmRNA量を比較すると加齢に伴った発現量の変動パターンが領域間で異なる可能性の存在することが示された。この各領域間の差異は、投射による錐体細胞間の相互作用と関連しているのではないかと考えている。更に、アルツハイマー病モデルマウスでは発現量の変動パターンが、野生型マウスと異なっていた。個体差や検体数について詳細な検討が必要ではあるが、海馬錐体細胞の変性は認知症発症と密接な関係にあり、発症メカニズムを解明する上で興味深い結果である。 以上のように、本研究では、非常に類似した構造を持つタウアイソフォーム(3Rtauと4Rtau)をタンパク質およびmRNAレベルでの特異性の高い検出・定量方法を確立し、更にこれを利用して得られた結果から、認知症発症メカニズムに対する新しい考え方を提示出来ることとなった。これらの方法を組み合わせることで、神経変性病理を伴う痴呆性疾患に対する新しい治療法や診断法の開発を促すことが期待できるものと考える。 |
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| Abstract | ||||||||||
| 内容記述タイプ | Other | |||||||||
| 内容記述 | Microtubule-associated protein tau is a predominant component of Neurofibrillary Tangles (NFTs) that is the major hallmark of the neurodegenerative disease containing Alzheimer's disease. This pathological change is induced by abnormal phosphorylation of tau. Phosphorylated tau become free from the microtubules, and then it is accumulated in cells. This tau abnormality may cause neuronal cell death. Many familial missense mutations found in tau gene have been identified by genetic analysis of Front-temporal dementia with parkinsonism linked to chromosome 17 (FTDP-17). Discovery of these mutations suggests that tau must be involved in developing demented diseases, so called tauopathy, associated mainly with NFTs and NFT-like changes. Six alternative splicing variants of tau protein are expressed in human brain. Which isoform expresses in brain depends on the stage of development and growth. The isoforms clarified as the three-repeat tau are selectively expressed in embryo. In addition, all six isoforms express in adult. Each isoform probably has specific physiological roles in brain. Isoforms of tau that deposit into insoluble aggregates in degenerated neurons observed as NFTs of tauopathies are different from each other. Therefore, it is important to make clear how and which isoform contributes to development and progress of the NFT associated dementia. In this study, the author firstly established the techniques to analyze biochemical features of tau gene and its products. By using these techniques, the three repeat and the four repeat tau isoforms were distinguishable from each other. And the amount of mRNA corresponding to each isoform was quantified with very high sensitivity. Secondly a biochemical property of tau protein and an expression of tau in brain were analyzed. The author focused on a structural feature of tau (the tertiary structure of the protein). And a change in the amount of mRNA for each isoform during aging and development of the diseases were also studied. The author firstly developed and characterized two novel conformation-sensitive polyclonal antibodies named T3R and T4R, which recognize specifically three- and four-repeat tau respectively. Two synthetic peptides, PGGGKVQIVYK (for T3R) and PGGGSVQIVYK (for T4R), containing the isoform specific residue and the β-sheet core motif VQIVYK named "PHF6" were designed as antigens for immunization. Experimentally identified sequences of their epitopes were confirmed to lie on the microtubule-binding domain and were consistent with those of the synthetic peptides. Although sequences of two antigens are closely resemble each other, there was no cross-reactivity between T3R and T4R. Furthermore, a binding affinity of T3R and T4R was reduced when the thioflavin-positive structure, ex. β-structure, was induced into their target. It is possible that conformational transition of the local short sequences in 3Rtau and 4Rtau is demonstrated by using those antibodies. These changes in tau structure may be detected before the abnormal tau aggregation accompanied with a folded form. Next, to analyze an effect of C-terminal portion bordering the epitope on the interaction of T3R and T4R with each target, the author used a set of serial C-terminal truncation mutants of each isoform. By western blotting, the binding affinity of T3R and T4R to each mutant was examined. The binding affinity of T3R and T4R to each target isoform without the C-terminal portion was higher than to the wild type of each isoform. T4R bound 3R-tau based variant, 3RΔC. Surprisingly, the binding avidity to it was higher than to 4R-tau. This cross reactivity was not observed by T3R. In addition, the fact that T4R bound to 3R-tau mutant 3RΔC was consistent with the result that T4R reacted to both 3RP^PHF6 and 4R^PHF6, synthetic peptides immobilized for ELISA. These data suggest that the C-terminal sequences just after the PHF6 motif function in forming the tertiary structure of this motif. And also structures recognized by T3R and T4R may be different from each other. The results mentioned above were correlated with the status of tau aggregation accompanied with forming a β-structure. C-terminal truncation variants of each isoform aggregated at lower ratio than the wild type isoforms did. Especially, 3RΔC showed no aggregation. When the aggregation of tau occurs, the binding avidity of T3R and T4R is reduced. This aggregation accompanies with the β-sheet conformation induced into tau. Therefore T3R and T4R may be used as indicators of abnormal tau aggregation resulting in NFT formation. By using them, we will have important knowledge about biochemical and pathological feature of each tau isoform. Many groups have studied on tau pathology focusing on the post-translational modification and metabolism of tau protein. Generally, they think that the post-translational processing is very critical for neurodegenerative change in tauopathies. However, it is not negligible that intracellular accumulation may correlate with the regulation of tau expression (transcription and translation). Especially, mechanisms for transcription and post-transcriptional processing of tau gene remain to be study in detail. To evaluate the regulation of tau expression, the author developed the quantitative protocol for determining the amount of tau mRNA with high sensitivity. Quantitative protocols have been previously reported from two groups. But sensitivity and specificity of their methods are not enough to analyze biochemical and pathological features of tau in neurodegenerative diseases in detail. The author selected one set of primers from a variety of primer sets and established quantitative protocol besed the real-time PCR using TaqMan Probe for measuring the amount of mRNA encoding 3Rtau and 4Rtau. By using the primer set the author selected, the fragment corresponding to the target sequence was exclusively amplified. Amplification of a non-specific fragment derived from sequence that was not the target region. Nonspecific signal derived from this unexpected amplicon was eliminated almost completely. In addition, transcripts for the two closely related tau isoforms could be distinguished very clearly by the techniques. The specificity and sensitivity of this method were evaluated by using total RNA synthesized in COS7 cells introduced with cDNA encoding 3Rtau or 4Rtau. Capped RNAs (cRNA) corresponding the target sequences were used to obtain the standard curve for accurate quantification. If mRNA was extracted from the tissue pieces dissected by using the laser micro dissection technique, the amount of mRNA from a couple of neurons could be accurately quantified as above. This small amount of mRNA was enough to quantify with significance. This novel quantifying method may allow us to trace the expression dynamics of tau mRNA of a small site containing a couple of cells in CNS and may provide us the new insight of a role of tau isoforms in neuronal function and neurodegeneration. Selective expression of each isoform in brain during development of human and mouse was observed in this study as previously reported. And specificity of the novel methods for measuring tau mRNA was confirmed by using total RNA extracted from whole brain samples of human embryo and the adult. Exclusively, 3Rtau was detected in embryo. On the other hand, both 3Rtau and 4Rtau was expressed in adult brain. These data were consistent with the result from Northern blot analysis previously reported. However, difference between the author's data and the previous reports was observed in the ratio of 3Rtau/4Rtau. From the Northern blotting, mRNAs of 3Rtau and 4Rtau expressed in adult human brain were detected at equal ratio (1:1). By using the author's method, it was revealed that the amount of 3Rtau mRNA might be different from that of 4Rtau. The ratio of 3Rtau/4Rtau was 2:3. This was the first report indicating that relative amounts of mRNA corresponding tau isoforms were different from each other. These results could not be revealed until the author's method was developed. Furthermore, the amount of 3Rtau mRNA obtained from Alzheimer's patient was higher than that from normal brain. The result may be very worth to analyze in detail for studying and developing either a diagnostics or therapeutic method. Frozen sections (40μm) of the mouse brain were stained with toluidine blue. Hippocampus pyramidal neurons (20 to 30 cells) were excised from CA1, CA2 and CA3 regions by using the laser micro dissection technique. Total RNAs extracted from the dissected pieces were subjected to the real-time PCR in order to quantified mRNA encoding each isoform. During aging, progress of changing in the amount of mRNA, that were extracted from CA1, CA2, and CA3 regions were different from each other. This progress in dynamics of mRNA expression may be altered by overexpression of Alzheimer's causative genes, APP and PS1 (PSAPP mouse). These data suggested that in hippocampus, the expression and the splicing of each isoform occurred in pyramidal cells might be regulated according to projection or innervation of the neurons. In AD, this regulation should be prevented. The author established novel techniques for detecting the transcripts and the proteins of tau isoforms (3Rtau and 4Rtau) derived from the single gene. Using these techniques, each tau isoform could be detected and quantified with high specificity. These techniques allow us to distinguish the two types of tau isoform very clearly. Combination of these methods will provide us a new insight for a therapeutic and a diagnostic approach for treating the demented disorders with neurodegenerative pathology. |
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| 学位名 | ||||||||||
| 学位名 | 博士(学術） | |||||||||
| 学位授与機関 | ||||||||||
| 学位授与機関名 | 麻布大学 | |||||||||
| 学位授与年月日 | ||||||||||
| 学位授与年月日 | 2006-03-15 | |||||||||
| 学位授与番号 | ||||||||||
| 学位授与番号 | 甲第16号 | |||||||||
| 著者版フラグ | ||||||||||
| 出版タイプ | AM | |||||||||
| 出版タイプResource | http://purl.org/coar/version/c_ab4af688f83e57aa | |||||||||
