WEKO3
アイテム
食肉からの腸管出血性大腸菌O157: H7の検査法に関する研究
https://az.repo.nii.ac.jp/records/3294
https://az.repo.nii.ac.jp/records/32948c597b6f-d6cb-4824-8fea-e48d519a689a
| 名前 / ファイル | ライセンス | アクション |
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diss_de_kou0009 (2.9 MB)
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diss_de_kou0009_jab.pdf (349.6 kB)
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| Item type | 学位論文 / Thesis or Dissertation(1) | |||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 公開日 | 2013-02-21 | |||||||||
| タイトル | ||||||||||
| タイトル | 食肉からの腸管出血性大腸菌O157: H7の検査法に関する研究 | |||||||||
| タイトル | ||||||||||
| タイトル | Examination methods of enterohemorrhagic E.coli O157: H7 in meat | |||||||||
| 言語 | en | |||||||||
| 言語 | ||||||||||
| 言語 | jpn | |||||||||
| 資源タイプ | ||||||||||
| 資源タイプ | thesis | |||||||||
| 著者 |
中島, 和英
× 中島, 和英
× Nakajima, Kazuhide
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| 抄録 | ||||||||||
| 内容記述タイプ | Abstract | |||||||||
| 内容記述 | 腸管出血性大腸菌O157:H7(以下;O157)は、1982年に米国で発生したハンバーガーを喫食したことを原因とする集団食中毒の患者からRilyら(1983)により初めて分離され報告された。それ以降、O157による感染症は、カナダおよび英国等の先進国で多発している。そのため世界規模で新興感染症として監視および予防対策が求められている。我が国では、小林ら(1985)によって1984年に大阪で発生した散発下痢症から分離した菌株から初めて確認され、その後1990年に埼玉県の幼稚園で、飲料水中のO157による集団発生が起こり注目された。その後毎年各地で散発的に発生していたが、1996年に堺市の小学校を中心とした集団食中毒は、世界的にも類を見ない大規模なものとなり世界中の専門家から注目された。 O157の感染源および感染経路については、初めて報告されて以来、各国の研究者により精力的に調査が行われ、ウシが高率に保菌していること、および食中毒原因食品として、牛肉が密接に関与していることが明らかにされた。 食品におけるO157の検査法は、培養法やELISA法等数多く報告されている。我が国においては、厚生労働省から「腸管出血性大腸菌O157の検査法について」(1997)が標準検査法として示されている。しかし、本検査法は正確な検査結果は得られるが、検査技術を要し迅速性も欠けるため行政検査等では有効であるが、食品工場の衛生管理上の検査法としては不向きである。そのため、食品工場の衛生管理上の検査法は、一般的にノボビオシン加mEC培地を用いて増菌培養を行い、その培養液をソルビトールマッコンキー培地で分離培養後、平板上に疑わしいコロニーが認められた場合にO157免疫抗体による凝集試験を行ういわゆる「簡易培養法」が広く汎用されている。しかし、簡易培養法でも、平板上のコロニーの判定等に経験を要し、迅速性も十分ではない。 そこで、著者は、食品工場の衛生管理上のO157検査を正確で迅速かつ合理的に行うための検査方法を検討した結果、新たに検査方法を開発するのに要する時間およびコストの面から市販のO157検出キットを使用することが最善であると考えた。市販のO157検出キットは、大きく分けELISA法を用いたキットとPCR法を用いたキットが市販されている。ELISA法を用いたキットは、迅速および簡便であるが、同一抗原を持つ競合菌との交差反応により偽陽性の誤判定になる可能性がある。一方、PCR法を用いたキットは、検査結果は正確ではあるが操作が煩雑であり経験が必要とされて来たが、最近では細菌の遺伝子解析等、PCR法を用いた検査がルーチン検査化されてきている。今回著者は、プライマー、ポリメラーゼおよびヌクレオチドが一つの錠剤に加工され、操作が著しく簡便であり、O157の有無をPCR反応後、電気泳動で判定する米国のQuaulicon社製「BAX^TMスクリーニングシステム」に着目し「BAX^TMスクリーニングシステム(以下;PCRキット法)と「簡易培養法」との検出限界を非加熱および60℃で10秒間加熱ダメージを与えたO157のVT2産生株およびVT1&2産生株のそれぞれ2菌株について検討し、また食品の中で特にO157汚染が危惧される食肉におけるO157検査法として、O157に汚染されていない4種類の市販食肉(牛肉、豚肉、鶏肉、牛レバー)を用いてO157のVT2産生株およびVT1＆2産生株の2菌株を接種して検出限界を調査し、その検査所要時間、操作性および検査コストについて比較し食肉加工工場における衛生管理上のO157検査の実用性を検討した。 また、著者はPCRキット法のみならずO157検査より一層の迅速化および食品製品類等の加熱工程により加熱ダメージを受けた極小量のO157を確実に増菌させるため、非加熱および60℃で10秒間加熱ダメージを与えた上記のO157の2菌株を用いて増菌培地(ノボビオシン加mEC培地およびトリプトソイブイヨン培地)、培養方法(静置培養および振とう培養)、培養温度(37℃および42℃)および培養時間(5、10および20時間)を組み合わせ、増菌培養の条件を検討した。その結果は以下の通りである。 1)PCRキット法のO157の2菌株の検出限界は、非加熱および加熱ダメージを与えた菌株は共に10^5cfu/mlであった。 2)簡易培養法では、O157の2菌株の非加熱および加熱ダメージを与えた菌株は、10^4cfu/ml以上でなければ検出できなかった。 3)牛肉、豚肉、鶏肉、および牛レバーにO157に2菌株を肉重量25g当たり10^0～10^3cfuの4段階になるように接種後、ノボビオシン加mEC培地を用いて37℃で20時間増菌培養を行った場合、PCRキット法の検出限界は2菌株ともに、牛肉、豚肉および牛レバーでは肉重量25g当たりの接種菌量が10^0cfuで検出できたが、鶏肉ではやや低く肉重量25g当たりの接種菌量が10^1cfuであった。 4)牛肉、豚肉、鶏肉および牛レバーにO157の2菌株を肉重量25g当たり10^0～10^3cfuの4段階になるように接種後、ノボビオシン加mEC培地を用いて37℃で20時間増菌培養を行った場合、簡易培養法の検出限界は、牛肉では肉重量25g当たりの接種菌量がVT2産生株は10^2cfu、VT1＆2産生株は10^1cfu、豚肉および鶏肉では2菌株とも肉重量25g当たりの接種菌量が10^1cfu、牛レバーでは肉重量25g当たりの接種菌量がVT2産生株は10^3cfu、VT1＆2産生株は10^2cfuで検出された。 5)PCRキット法と簡易培養法の実用性を比較検討した結果は、検査所要時間は簡易培養法では40時間、PCRキット法では25時間であり、PCR法は簡易培養法の約2/3の時間で検査が終了した。また操作性は、簡易培養法は釣菌技術および分離培地に発育したコロニーの判定に経験が必要であるが、PCRキット法は、主な試薬が錠剤化されているためマイクロピペットの操作が正確に出来れば検査ができた。 6)O157の増菌培養の迅速化は、培地種類、培養温度に係わらず振とう培養を行うことが効果的であった。 以上のことから、食品工場の衛生管理上のO157検査法として、現在食品工場で広く汎用されている「簡易検査法」より米国Qualicon社製の「BAX^TMスクリーニングシステム」を使用することにより正確で迅速かつ合理的に行えることを明らかにした。またO157検査のなお一層の迅速化として、増菌培養を行うとき振とう培養を行うことにより増菌培養時間を短縮できることを明らかにした。 |
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| Abstract | ||||||||||
| 内容記述タイプ | Other | |||||||||
| 内容記述 | Enterohemorrgic E. coliO157: H7 (O157) was first isolated by Rily et al. (1983) from patients during mass food poisoning due to eating of hamburgers that occurred in the u. s. in 1982. Since then,O157 infection has frequently occurred in advanced countries such as Canada and England. Therefore, global-scale surveillance and preventive measures for this new infection have been advanced. In Japan, Kobayasi (1985) was the first to confirm O157 in cell strains isolated from patients with sporadic diarrhea occurring in Osaka in1984. In 1990, there was a mass outbreak due to O157 in drinking water in kindergarten in Saitama Prefecture. Subsequently, O157 infection sporadically developed every year in various districts. However, in1996, amass food poisoning occurred mainly in primary schools in Sakai City, which attracted the special attention because of its unprecedented large scale. Since the first report of O157 infection, extensive investigations on the infection sources and route by researchers in various countries have shown a high O157 carrier rate in cattle and a close association of beef in the development of food poisoning. Various O157 examination methods in food such as culture methods and ELISA have been reported. In Japan, the Ministry of Health, Labour, and welfare proposed " Examination method of enterohemorrhagic E. coli O157 (1997) " as a standard method. Though accurate are obtained, this method requires skills and is time-consuming. This method is therefore useful in administrative examination but inappropriate in sanitary management in food factories. In sanitary management in food factories, the following so-called "simple culture method" is widely used. Enrichment culture using mEC medium supplemented with novobiocin is performed, followed by isolation culture in Sorbitol MacConkey medium. When suspected colonies are observed on plates, an agglutination test using O157 antibody is performed. However, this simple culture method also requires experience in the identification of colonies on plates and still takes considerable time. To perform accurate, rapid, and rational O157 examination in sanitary management in food factories, we evaluated various methods and found that the use of commercially available O157 kits is optimal, considering the time and cost need for the development of new methods. Commercially available O157 kits are classified into two types that use ELISA or PCR. Using the ELISA type kit, examination is rapid and simple, but false-positive results are sometimes obtained due to cross-reactions with competitive bacteria with the same antigen. Using the PCR type kit, accurate results have been obtained, but a complicated procedure and experience are necessary. However, recently, examination by PCR using bacterial genetic analysis has become a routine method. We noted the BAX^TM Screening System (Qualicon, USA) in which the primer, polymerase, and nucleotide are processed so as to be contained in one tablet. The procedure using this system is very simple, and the presence or absence of O157 is determined by electrophoresis after PCR. The detection limit was compared between the BAX^TM Screening System(PCR kit method) and the simple culture method in unheated or heated (60℃,10 seconds) O157 VT2-producing and VT1&2 producing strains were inoculated into 4 types of commercially available meat (beef, pork, chicken, and beef liver) not contaminated by O157. Also, the time required and the practicability of theO157 examination in sanitary management in meat processing factories was evaluated. To further shorten the time of not only the PCR kit method but also O157 examination, the following conditions of enrichment culture were evaluated using the unheated and heated (60℃,10 seconds) VT2-producing and VT1&VT2 producing O157 strains : medium (mEC medium supplemented with novobiocin or tryptosoy bouillon medium), method(static, shaken), temperature(37℃, 42℃), and time (5, 10, and 20houre). From above mentioned experiments, the following results were obtained. 1) The detection limit of the PCR kit method was 10^5cfu/ml for both the unheated and heated VT2-producing and VT1&2-producing strains. 2) The detection limit of the simple culture method was 10^4cfu/ml for both unheated and heated VT2 and VT1&VT2 producing strains. 3) When the 2 strains (VT2, VT1&2) of O157 were inoculated at 4 concentrations (10^0-10^3cfu/25g) to beef, pork, chicken, and beef liver and cultured in mEC medium supplemented with novobiocin at 37℃ for 20 hours, the detection limit of the PCR kit method was 10^0cfu/25g of each strain in beef, pork, and beef liver, but 10^1cfu/25g in chicken. 4) When the 2 strains of O157 were inoculated at 4 concentrations (10^0-10^3cfu/25g) to beef, pork, chicken, and beef liver and cultured in mEC medium supplemented with novobiocin at 37℃ for 20 hours, the detection limit of the simple culture method was 10^2cfu/25g for the VT2 producing strain and 10^1cfu/25g for the VT1&VT2-producing strain in beef, 10^1cfu/25g for both strain in pork and chicken, and 10^3cfu/25g for the VT2-producing strain and 10^2cfu/25g for the VT1&2-producing strain in beef liver. 5) Practicability was compared between the PCR kit method and simple culture method. The examination time of the PCR kit method (25 hours) was about 2/3 that of the simple culture method (40 hours). Concerning operability, experience was necessary for the pipetting technique and the identification of colonies the grew on the isolation medium. The PCR kit method could be more readily performed when the micropipetting technique could be accurately performed because major reagents are contained in the tablet. 6) To shorten the examination time of O157 culture, shake culture was useful irrespective of the type of medium or culture temperature. These results suggested that more accurate, rapid, and rational O157 examination in sanitary management in food factories is possible using the BAX^TM Screening System (Qualicon, USA) rather than the simple culture method widely used at present in food factories. In addition, shake culture can further shorten the enrichment culture time in the O157 examination. |
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| 学位名 | ||||||||||
| 学位名 | 博士(学術） | |||||||||
| 学位授与機関 | ||||||||||
| 学位授与機関名 | 麻布大学 | |||||||||
| 学位授与年月日 | ||||||||||
| 学位授与年月日 | 2002-03-15 | |||||||||
| 学位授与番号 | ||||||||||
| 学位授与番号 | 甲第9号 | |||||||||
| 著者版フラグ | ||||||||||
| 出版タイプ | AM | |||||||||
| 出版タイプResource | http://purl.org/coar/version/c_ab4af688f83e57aa | |||||||||
