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アイテム
実験動物のマウスから分離されたBordetella hinziiの生物学的性状と病原性に関する研究
https://az.repo.nii.ac.jp/records/3255
https://az.repo.nii.ac.jp/records/3255848385a0-8d81-4fff-bee7-074d625d19ec
| 名前 / ファイル | ライセンス | アクション |
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diss_dv_otsu0424 (11.5 MB)
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diss_dv_otsu0424_jab&rev (251.6 kB)
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| Item type | 学位論文 / Thesis or Dissertation(1) | |||||||||
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| 公開日 | 2013-02-13 | |||||||||
| タイトル | ||||||||||
| タイトル | 実験動物のマウスから分離されたBordetella hinziiの生物学的性状と病原性に関する研究 | |||||||||
| タイトル | ||||||||||
| タイトル | Studies on the biological features and pathogenicity of bordetella hinzii derived from laboratory mice | |||||||||
| 言語 | en | |||||||||
| 言語 | ||||||||||
| 言語 | jpn | |||||||||
| 資源タイプ | ||||||||||
| 資源タイプ | thesis | |||||||||
| 著者 |
林元, 展人
× 林元, 展人
× Hayashimoto, Nobuhito
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| 抄録 | ||||||||||
| 内容記述タイプ | Abstract | |||||||||
| 内容記述 | 「第I章 マウスからのBordetella hinzii分離例と分離株の生物学的性状」 著者は呼吸器症状(小鳥が鳴くような異常呼吸音)を示す1匹のC57BL/6マウスの気管ならびに肺から、オキシダーゼ陽性、カタラーゼ陽性のグラム陰性桿菌を純培養の状態で分離した。このマウスは既知の病原体の検査は全て陰性であった。症状を示したマウスの肺副葉は赤色肝変化していたが、その他の臓器に肉眼的な著変は認められなかった。また、このマウスに対し病理組織学的検査を実施した結果、鼻炎、気管炎ならびに気管支肺炎が認められた。16S rRNA遺伝子の塩基配列の解析を実施した結果、分離株はデータベース上のB.hinziiのデータと高い相同性(99.9%)を示した。続いて実施したBordetella属他種菌との16S rRNA遺伝子の塩基配列系統樹解析の結果、分離株はB.hinzii LMG 13501T株とともに独立したクラスターを形成した。以上の結果からマウスからB.hinziiを分離・同定し、本菌がマウスの呼吸器病変に関与している可能性を示した。 「第II章 B.hinziiマウス由来株のマウスに対する病原性の解明」 B.hinzii分離株のマウスへの病原性を明らかにするために、免疫機能が正常なマウス(ICRマウス)ならびに免疫機能不全マウス(NOD-scidマウス)を用い感染実験を実施した。接種菌液濃度が異なる2群(1群5匹、高濃度群: 10^7CFU/ml、低濃度群: 10^3CFU/ml)を設定した。菌液接種後、NOD-scidマウスでは3日目までに、ICRマウスでは10日目までに、全匹において小鳥の鳴くような異常呼吸音が観察された。また、NOD-scidマウスでは軽度の呼吸困難も観察された。これらの症状は実験期間中継続したが、ICRの症状は時間とともに軽微になっていった。実験期間中に高濃度菌液接種群ならびに低濃度菌液接種群のNOD-scidマウスそれぞれ1匹が死亡した。また、高濃度接種群のNOD-scidマウス2匹に重度の呼吸困難が観察されたため、安楽死を実施した。実験期間終了後の剖検ではマウス全例において、肉眼的な著変は観察されなかったものの、病理組織学的検査ではICRマウスとNOD-scidマウスに鼻炎ならびに気管支肺炎が観察された。この病像に加えNOD-scidマウスでは、全例において間質性肺炎も観察された。菌分離では菌液を接種したマウス全例の鼻腔、気管、盲腸から菌が分離された。また低濃度菌液接種群のICRマウス1例を除く全例の肺から菌が分離された。これらの結果から、B.hinziiがマウスに呼吸器感染症を引き起こすことを証明した。 「第III章 わが国のマウス実験動物施設におけるB.hinziiの流行様態調査と感染マウスの病態」 わが国におけるB.hinziiの流行様態を調査するために、延べ1020施設由来の6040匹のマウスに対し、気管からの菌分離を行った。また、自然感染下でのB.hinziiの病態を調査するために、任意のマウスにおいて、鼻腔、肺からの菌分離を実施すると同時に、病理組織学的検査を実施した。調査の結果、24施設の大学・研究所実験動物施設由来の88匹のマウスがB.hinziiを保有していた。製薬会社の実験動物施設由来のマウスに、B.hinziiを保有しているものはいなかった。調査した890の大学・研究所の施設のB.hinzii陽性率は2.7%と、同時期に実施した調査における蟯虫(Aspiculuris spp.またはSyphacia spp.、3.0%)、Mouse hepatiUs virus(2.9%)と同程度であった。88匹のB.hinzii保菌マウスのうち、既知の病原体との混合感染が認められなかった59匹から任意で選んだ14匹のマウスに対して、鼻腔、肺からの菌分離と病理組織学的検査を実施した。その結果、全例において、気管だけではなく鼻腔からもB.hinziiが分離されたが、肺からは分離されなかった。これらのマウスでは、14匹全例において病理組織学的検査で鼻炎が確認されたが、肺には病変は確認されなかった。本結果から、わが国のマウス飼育実験動物施設にB.hinziiが広く存在していることを明らかにした。また、B.hinziiが自然感染下においてマウスの鼻腔に病変を形成することも明らかにした。 「第IV章 B.hinziiの分子生物学的同定法の確立」 次にB.hinziiを迅速に同定することが可能なPolymerase Chain Reaction(PCR)同定法の確立を目指し、特異的なPCRプライマーの設計を行い、その評価を実施した。PCRプライマーの標的としたDNAジャイレースサブユニットB(gyrB)遺伝子の配列を決定するために、B.hinziiマウス由来株3株を用い、塩基配列を決定した。その塩基配列を基に1組のプライマーセット、CZO7ならびにNJO5を設計した。これらプライマーのB.hinziiの特異性を確認するために、データベース上の全塩基配列と比較した。そして、B.hinziiマウス由来株88株、B.hinzii ATCC 51783株、B.hinzii以外のBordetella 属菌7株ならびに既知のマウス呼吸器病原菌(Corynebacterium kutscheri、Pasteurella pneumotoropica、mycoplasma pulmonis)の3株に対してPCRを実施した。その結果、PCRプライマーCZO7ならびにNJO5と完全に一致する配列はデータベース上には見つからなかった。また、本プライマーセットを用いたPCRではB.hinziiマウス由来株88株とB.hinzii ATCC 51783株からは推定された大きさ(774 bp)のPCR産物が確認され、それ以外の菌種からは遺伝子の増幅は確認されなかった。これらの結果から、B.hinzii特異的なPCRプライマーセットの特異性が確認され、本菌の迅速な同定が可能なPCR同定法を確立できた。 「総括」 本研究により、B.hinziiがマウスの呼吸器病原体であること、そして、わが国の実験動物施設に広く流布していることが明らかになった。また、本菌を迅速に同定することが可能な特異的プライマーセットを用いたPCR同定法を確立した。本研究はB.hinziiをマウスから分離し、病原体として証明した初めての報告である。今後、本菌は実験動物のマウスの微生物学的統御の対象として、継続的に検査を実施する必要があると考えられる。本菌に関するこれらの研究結果は、今後の実験動物の微生物学的コントロールに有用な多くの資料と示唆を提示できたと考える。 |
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| Abstract | ||||||||||
| 内容記述タイプ | Other | |||||||||
| 内容記述 | Bordetella hinzii was isolated from the trachea and lungs of a laboratory mouse (C57/BL6) with a respiratory infection, and identified based on its phenotypic and genetic traits. The mouse showed symptoms of sneezing with a chattering sound and without nasal discharge, and histopathological examination revealed rhinitis, tracheitis, and bronchopneumonia. The isolate was a Gram-negative, oxidase- and catalase-positive, short rod-shaped organism that produced alkali from malonate. The results of biochemical identification by API 20NE, the alkali production test from malonate, and partial sequence analysis of the 16S rRNA gene (1523 bp) were consistent with those reported previously for B. hinzii. These results suggested the possibility that B.hinzii was associated with clinical disorders and histopathological lesions in the mouse. To clarify the pathogenicity of B.hinzii in respiratory tracts of mice, experimental infection studies were performed using ICR and NOD-scid mice. Ten mice of each strain were divided into two experimental groups inoculated with either a high or low dose of the bacterial suspension (5×10^7ml or 5×10^3ml, respectively). By postinoculation day 3, all infected NOD-scid mice showed sneezing with a chattering sound and slight dyspnea, as did all infected ICR mice by postinoculation day 10. The symptoms lasted throughout the experimental period (28 days after inoculation) in all mice. The sneezing in ICR mice gradually became less frequent over time. None of the ICR mice died, but four of the NOD-scid mice died or were euthanized for humane reasons due to severe dyspnea. Histopathological examination revealed catarrhal rhinitis and bronchopneumonia in both strains of mice and interstitial pneumonia in NOD-SCID mice. The isolate was re-isolated from the nasal cavity, trachea, and lungs by pure culture. These results suggested that B.hinzii is a novel causative agent of respiratory disease in mice. To investigate of the prevalence of B.hinzii in mouse facilities in Japan, a survey was performed on 6,040 mice from 1,020 facilities in total. Isolation of B.hinzii was performed using tracheal swabs of mice. In addition, to investigate the pathology in naturally B.hinzii-infected mice, isolation of B.hinzii from the nasal cavities and lungs and a histopathological examination were performed on selected B.hinzii-infected mice. As a result, 88 B.hinzii-infected mice were found in 24 out of 890 facilities tested in universities and research institutes. In such faclities, the positivity of B.hinzii (2.7%) was mostly the same as that of pinworms (3.0%) and of mouse hepatitits virus (2.7%). No B.hinzii-infected mice were observed in all 130 facilities tested in pharmaceutical companies. B.hinzii was isolated from nasal cavities and the trachea but not the lungs in all 14 selected B.hinzii single infected mice. In these 14 mice, rhinitis was observed but no gross lesions in lungs were observed histopathologically. From these results, the prevalence of B.hinzii in mouse facilities in Japan was revealed, and the pathogenicity of B.hinzii was revealed in the nasal mucosa in mice with natural infections. Lastly, to develop PCR which can identify isolates of B.hinzii rapidly, B.hinzii specific PCR primers were designed and evaluated. The DNA gyrase subunit B (gyrB) gene was selected as the target of PCR primers. The gyrB gene of three isolates of B.hinzii was sequenced, and then the specific primers, CZO7 and NJO5, were designed based on the sequence. The specificity of these primers for B.hinzii was evaluated by a homology search in public data banks for all deposited data, and an actual PCR trial for the type strain of B.hinzii (ATCC 51783), 88 isolates of B.hinzii derived from mice, seven strains of other Bordetella species, and three strains of respiratory pathogens for mice (C.kutscheri, P.pneumotropiea and M.pulmonis). Results of the homology search in public data banks, found no sequence data that completely agree with the sequence of PCR primers. In the results of the actual PCR trial, PCR products with expected size (774 bp) were obtained from the type strain of B.hinzii and 88 isolates of B.hinzii but were not obtained from other bacterial species tested. From these results, specific PCR for identification of B. hinzii was developed. In conclusion, the pathogeniciy of B.hinzii was revealed by experimental infections and investigation of naturally infected mice. Also the prevalence of B.hinzii in mouse facilities in Japan was revealed, and PCR that can identify isolates of B.hinzii was developed. This is the first report of the isolation of B.hinzii from mice, and the first report that describes the pathogenicity of B.hinzii in mice. B.hinzii should be eliminated from laboratory mouse facilities due to its pathogenicity for mice. |
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| 学位名 | ||||||||||
| 学位名 | 博士（獣医学） | |||||||||
| 学位授与機関 | ||||||||||
| 学位授与機関名 | 麻布大学 | |||||||||
| 学位授与年月日 | ||||||||||
| 学位授与年月日 | 2010-10-25 | |||||||||
| 学位授与番号 | ||||||||||
| 学位授与番号 | 乙第424号 | |||||||||
| 著者版フラグ | ||||||||||
| 出版タイプ | AM | |||||||||
| 出版タイプResource | http://purl.org/coar/version/c_ab4af688f83e57aa | |||||||||
