WEKO3
アイテム
免疫ペルオキシダーゼプラック染色法の犬ウイルス抗体測定への応用に関する研究
https://az.repo.nii.ac.jp/records/3241
https://az.repo.nii.ac.jp/records/32415c5eb560-fe9c-4e10-b99a-fb0cc4117c57
| 名前 / ファイル | ライセンス | アクション |
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diss_dv_otsu0392 (11.6 MB)
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| Item type | 学位論文 / Thesis or Dissertation(1) | |||||||
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| 公開日 | 2013-02-13 | |||||||
| タイトル | ||||||||
| タイトル | 免疫ペルオキシダーゼプラック染色法の犬ウイルス抗体測定への応用に関する研究 | |||||||
| 言語 | ||||||||
| 言語 | jpn | |||||||
| 資源タイプ | ||||||||
| 資源タイプ | thesis | |||||||
| 著者 |
相馬, 武久
× 相馬, 武久
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| 抄録 | ||||||||
| 内容記述タイプ | Abstract | |||||||
| 内容記述 | 中和試験は最も信頼性の高い抗体検査方法であるが、迅速性、簡便性、経済性の面で劣るため、日常的な臨床検査方法としては適当とは言えない。一方、赤血球凝集抑制(HI)試験は中和試験と同等の特異性に簡便性を兼ね備えているが、赤血球凝集能を持たないウイルスには適応できない欠点がある。近年、簡便かつ鋭敏に測定できる酵素結合抗体免疫吸着法(ELISA)が報告され、現在では医学や獣医学領域で最も広く利用されている。しかし、ELISAは非特異反応により正確な結果判定ができないことがある。1982年にこのELISAの欠点を補足できる方法として、免疫ペルオキシダーゼプラック染色法(IP法)によるアフリカ豚コレラウイルス抗体検査が報告された。本法はウイルス感染細胞であるプラックを抗原とする酵素抗体法で、一つのウエル内にプラック以外の非感染細胞領域を設けることで、非特異反応を容易に区別することができる。そして、本法の検査手技はELISAに類似していることから、迅速性と簡便性においても優れている。 そこで、本研究ではIP法を犬ウイルス感染症の診断へ応用する目的で、主要な犬ウイルスの中でHI試験の適用が困難な犬ジステンパーウイルス(CDV)、犬コロナウイルス(CCoV)、犬ヘルペスウイルス(CaHV)についてIP法による抗体検査系を確立するとともに、野外への応用性を検討した。また、本邦ではこれら3種類のウイルスについての疫学調査はこれまで十分に行われていない。そこで、IP法を用いて本邦での野外での抗体保有状況を検討した。 1. IP法による検査法の確立 抗原プレートの条件をまず検討した。培養細胞としては最も明瞭なプラックが観察されたVero細胞(CDV)、CRFK細胞(CCoV)、A-72細胞(CaHV)を使用することとした。この細胞に感染させるウイルス力価としては、3種類のウイルスともにウエル内に適度に広がり肉眼で観察しやすい30PFU/ウエルとした。プラック形成のためには操作性の面でメチルセルロースを採用し、40時間の培養後メタノールで固定し、抗体検査に供試した。抗体検査でのプラックの発色にはジアニシジンを採用した。結果判定はシャーカステン上で行い肉眼にて茶褐色のプラックが観察されたウエルを抗体陽性とし、この染色像が観察できたウエルの最高の血清希釈倍率を抗体価とした。そして、非特異反応により非感染細胞が染色した場合でもプラックはより濃く染色されるため抗体価の判定が容易であった。 2. 供試犬ウイルスに対する抗血清と非免疫SPF犬血清との特異性 CDV、CCoVおよびCaHVに対するIP法はそれぞれのウイルス以外の犬ウイルスに対する抗血清と非免疫SPF犬の血清とは全く反応性を示さず、それぞれのウイルスに対する抗体を特異的に検出することが示された。 3. CDVに対するIP法の検討 3-1. SPF犬に対するワクチン投与による抗体応答 SPF犬114頭(CDVワクチン接種犬84頭と非免疫犬30頭)の血清について検討したところ、中和抗体陽性例(抗体価≧1:3)は全例ともIP抗体陽性(抗体価≧1:10)、中和抗体陰性例は全例ともIP抗体陰性で両検査法の結果は一致した。次に、両抗体価の相関性を検討したところ、r=0.953と高かった。なお、回帰直線式はy=0.884x-0.252(y=log_10 中和抗体価の逆数、x=log_10 IP抗体価の逆数)であった。さらに、CDVワクチンをSPF犬12頭に接種した後の血清中抗体価の推移を検討したところ全頭において両抗体価は同様な推移を示した。これらの成績からIP法はワクチン効果など防御能判定のための簡便法として有用であることが示された。このため中和試験での発症防御能の判定基準値1:32に相当するIP抗体価を上述の回帰直線式で算出し、抗体価1:160をIP法で判定基準値とした。 3-2. 野外犬での抗体保有率 家庭で飼育されている健康犬584頭の血清についてIP抗体保有率を検討した。抗体陽性率(抗体価≧1:10)と防御能(抗体価≧1:160)を保有する例の比率は全体でそれぞれ76.5%、62.5%で両率ともに9歳齢以降低下傾向を示し、特に防御能を保有する例の比率の低下が顕著であった。近年、ペット社会でも老齢化が急速に進行しており、老齢による免疫力の低下が問題視されている。本検討の結果はこのことを裏付ける貴重なデータであり、特に老齢犬では定期的に抗体検査を行い、その検査結果によってワクチンの再接種を検討する余地が示された。さらに、IP法は健康診断など多数のサンプルを検査するために非常に適した方法であることが本検討から明らかとなった。 3-3. 野外犬でのIP法と中和試験の比較 健康犬50頭および犬ジステンパー(CD)被疑症例(神経症状発現例103頭、非発現例83頭)の血清について検討したところ、健康犬では中和抗体陽性例は全てIP抗体陽性、中和抗体陰性例は全てIP抗体陰性で両検査法の結果は一致した。CD被疑症例では中和抗体陽性例は全てIP抗体陽性であったが、中和抗体陰性例の71.7%(33/46)(神経症状発現例)、65.5%(19/29)(神経症状非発現例)がIP抗体陽性であった。このようにIP法はこれまでのELISAと同様にCD症例に対し高い抗体検出率を保有している上に優れた特異性、操作性を有することから、CDの診断のために極めて有効な抗体検査法であることが明らかとなった。 3-4. IP-NT値による診断指標の検討 IP抗体価と中和(NT)抗体価の差(IP-NT値;log_10 IP抗体価の逆数-log_10 中和抗体価の逆数)を検討したところ、健康犬、神経症状発現CD被疑症例、非発現CD被疑症例での平均値と標準偏差(SD)は、それぞれ0.616±0.385、1.631±0.834、1.348±0.837で、CD被疑症例の平均値は健康犬に比べ有意に高い値を示した(p<0.01)。そして、一群の99%が含まれるとされている「平均値±3SD(SDの3倍)」について検討したところ、健康犬の上限値(平均値＋3SD)は1.8で、CD被疑症例では神経症状発現時の41.1%、非発現例の31.5%がこの上限値を上回っていた。この成績からIP-NT値>1.8はCDの診断指標の一つとして有効であることが示された。 さらに、初診時にIP-NT値>1.8で神経症状非発現のCD被疑症例15頭についてその後の症状の変化について調査したところ、12頭(80%)が1ヶ月以内に神経症状を発現した。このことから、IP-NT値はCDの診断だけでなく神経症状発現の予後診断としても有効であることが示された。 4. CCoVに対するIP法の検討 4-1. 実験感染犬での抗体価の推移 SPF犬3頭にCCoV野外分離株を接種したところ、3頭とも血清中の両抗体価は同様な推移で上昇した。 4-2. 野外犬でのIP法と中和試験の比較 健康犬240頭と下痢症例(1歳未満115頭、1歳以上72頭)の血清について検討したところ、健康犬では中和抗体陽性例(抗体価≧1:3)は全てIP抗体陽性例(抗体値≧1:40)、中和抗体陰性例は全てIP抗体陰性で両検査法の結果は一致した。下痢症例では中和抗体陽性例は全てIP抗体陽性であったが、中和抗体陰性例の20.3%(15/74)(1歳未満)、2.1%(1/48)(1歳以上)がIP抗体陽性であった。この成績から本IP法はCDVと同様に実際の臨床例において高い抗体検出率を示し、CCoV感染症の診断に有用であることが明らかとなった。 4-3. IP-NT値による診断指標の検討 健康犬、1歳未満の下痢症例、1歳以上の下痢症例でのIP-NT値の平均値とSDは、それぞれ0.982±0.447、2.350±0.931、1.404±0.896で、下痢症例の平均値は健康犬に比べ有意に高い値を示した(1歳未満、1歳以上それぞれP<0.01、P<0.05)。そして、健康犬でのIP-NT値の平均値＋3SDは2.3で、下痢症例では1歳未満の例の57.1%、1歳以上の例の24.0%がこの値を上回っていた。この成績からIP-NT値>2.3はCCoV感染症の一つの診断指標として有用であることが示された。 4-4. 野外犬での抗体保有率 家庭で飼育されている健康犬240頭の血清について検討したところ、CCoVに対するIP抗体陽性率は25.0%(60/240)で、本邦での真の抗体保有状況が明らかとなった。また、下痢症例の陽性率は1歳未満、1歳以上の例それぞれ48.7%(56/115)、34.7%(25/72)で、両者間に有意差はなかったが、前者は健康犬に比べ有意に高い陽性率を示した(p<0.01)。この成績からCCoVが特に若齢犬での下痢症状の発現に大きく関与していることが示された。 さらに、下痢症状を血清中抗犬パルボウイルス(CPV)IgM抗体の有無で検討したところ、IgM抗体陰性例、陽性例のCCoVに対するIP抗体陽性率はそれぞれ62.2%(23/37)、38.1%(16/42)で、陰性例は陽性例と健康犬に比べ有意に高い陽性率を示した(それぞれp<0.05、p<0.01)。この成績から、下痢症の診断にはCPV以外にCCoVの検査も併行して行う必要性が示された。 5.CaHVに対するIP法の検討 5-1. 実験用ビーグル犬と野外犬でのIP法と中和試験の比較 CaHVが浸潤した実験施設のビーグル犬53頭、健康犬590頭、慢性的な呼吸器症状を呈している症例35頭の血清について検討したところ、三者とも中和抗体陽性例(抗体価≧1:10)は全てIP抗体陽性(抗体価≧1:10)であったが、中和抗体陰性例のそれぞれ23.8%(5/21)、0.5%(3/575)、3.5%(1/29)がIP抗体陽性であり、IP法は中和試験に比べ高い抗体検出率を示しCaHV感染症の血清診断に有用であることが明らかとなった。 5-2. IP-NT値による診断指標の検討 実験用ビーグル犬、健康犬および呼吸器症例でのIP-NT値の平均値とSDはそれぞれ、1.280±0.520、1.220±0.441、1.106±0.334で三者間に有意差はなく、IP-NT値の診断指標としての有用性は示されなかった。 5-3. 野外犬での抗体保有率 家庭で飼育されている健康犬590頭の血清について検討したところ、IP抗体陽性率は3.1%(18/590)で非常に低率であることが明らかとなった。これに対し、呼吸器症例の陽性率(20.0%;7/35)は健康犬に比べ有意に高く(p<0.01)、CaHVが呼吸器症状に関与するという一般的な傾向を裏付ける結果であった。 6.多数飼育犬群での抗体陽性率の検討 CCoV、CaHVについて、それぞれ5施設、4施設のブリーダーにおけるIP抗体陽性率を検討したところ、抗CCoV抗体陽性率は100%、100%、90.0%、0%、0%、抗CaHV抗体陽性率は100%、69.8%、0%、0%であった。そして、抗体陽性例が認められた施設の陽性率は健康犬(CCoV25.0%、CaHV 3.1%)に比べ有意に高く(p<0.01)、多頭飼育環境にこれらのウイルスが侵入した場合は陽性率が著しく高まることが示された。このため、犬の移動や導入に際して、IP法によりCCoVやCaHVの感染をチェックする必要があるものと思われた。 本研究はIP法を犬ウイルス感染症の診断に応用した最初の報告であり、従来法の中和試験やELISAに比べて高い特異性、簡便性および鋭敏性を保有していることが示された。また、CDVとCCoVについてはIP法に中和試験を併用することで、極めて有効な診断方法(IP-NT値)を確立することができた。このような知見についての従来の報告はなく、今回初めて明らかにすることができた。 さらに、これまで十分に行われていなかった本邦でのCDV、CCoV、CaHVに対する抗体保有状況を家庭犬について検討し、その抗体保有率を明らかとした。 以上のことから、IP法は犬ウイルス感染の診断に対し極めて有用性の高いものであることが示された。 |
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| Abstract | ||||||||
| 内容記述タイプ | Other | |||||||
| 内容記述 | Along with a recent trend to characterize pet dog as companion animal, further improvement has been required in veterinary medicine based essentially on an accurate diagnosis. Regarding the diagnosis of infectious diseases, neutralizing test (NT) is the most reliable antibody test widely used; however, due to disadvantages in lacking rapidity, simplicity and economic efficiency, the test is not suitable for routine laboratory practice. Hemagglutination inhibition (HI) test provides simplicity along with the specificity equivalent to that of the NT, yet it is only applicable to detect viruses demonstrating hemagglutination activity. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has recently been demonstrated as a simple and accurate detecting method and is currently utilized most frequently in the field of veterinary medicine. However, because of the non-specific reactions, ELISA sometimes yields an ambiguous result to determine. Immunoperoxidase plaque staining (IP) test was demonstrated in 1982 to compensate for the defect associated with ELISA. In this enzyme antibody technique, plaque, a cluster of virus-infected cells, is used as an antigen and raised in a testing well concomitantly with an uninfected cell layer, providing readily distinguishable appearance of non-specific reactions. The test procedures are similar to those of ELISA. In this study, to examine the diagnostic application of the IP test to canine virus infections, we established antibody test systems for canine distemper virus (CDV), canine coronavirus (CCoV) and canine herpesvirus (CaHV), in which the HI test is less applicable, and examined the possibility to apply the system to the field of canine practice. The epidemiological surveys on these viruses in Japan have not yet been completed; therefore, we conducted the field studies to examine the prevalence of antibodies to these viruses using the IP test. 1. Establishment of antibody test system by IP test First, conditions of antigen plates were examined to establish a diagnostic system with the IP test. Vero, CRFK and A-72 cells, which provided clearly observable plaque, were used for cell culture in the CDV-, CCoV- and CaHV-IP tests, respectively. These were infected with each virus at titers of 30 plaque forming units (PFU)/well, providing an appropriate viral density per well for easy observation. The infected cells were incubated for 40 hours on a methylcellulose underlay to support plaque formation and to simplify subsequent operations, followed by fixation with ethanol and these plates were used for the antibody test. For determination, the wells were stained with o-dianisidine to reveal plaque. A test sample was determined positive when brown-colored plaques were observed. The highest serum dilution showing this color development was regarded as IP titer. The color reaction given by the plaques was clear, even when some color developed on uninfected cells in the background owing to non-specific reactions, because the coloration of the plaques was much stronger. We also examined the influences of long-term storage and lot-to-lot variation on the quality of the IP antigen plates. The antigen titers for CDV, CCoV and CaHV were well preserved in the IP plates stored in -20℃ for six months after the production, and were not affected by lot-to-lot variation. These results demonstrate that the IP test constantly provides stable antibody determination. 2. Specificity of IP test The specificity of the IP tests was examined by exposing the CDV-, CCoV- and CaHV-IP antigen plates to antisera containing several antibodies against canine viruses. There were no cross-reactions with the antisera in each IP plate, indicating that the IP test specifically detects the target antibody. 3. Application of IP test to CDV 3-1. Antibody responses of CDV-vaccinated SPF dogs When the antibody response was examined in 84 specific pathogen-free (SPF) dogs that had received CDV vaccine and 30 unimmunized SPF dogs, all the sera from unimmunized SPF dogs that had negative NT titers showed negative IP titers. All the sera from the vaccinated SPF dogs that had positive NT titers showed positive IP titers. There was a strong correlation between the IP and NT titers (r=0.953). The regression line was as follows: y= 0.884x-0.252. Then, when 12 SPF dogs were inoculated with CDV vaccines, both titers followed a similar course after the inoculation in all the dogs. These findings indicate that the IP test has specificity similar to that of the NT. Based on the above regression line, an NT titer of 1:32, which was estimated as a criterion for defensive ability against canine distemper (CD), was then converted into an IP titer of 1:160 to establish the evaluation criterion for the IP test. 3-2. Prevalence of antibody in companion dogs The IP test was used to investigate the prevalence of the antibody in sera from 584 healthy dogs. The percentages of sera that had positive IP titers (≧1:10) and that reached the criterion (≧1:160) were 76.5% and 62.5% of all sera tested, respectively. These percentages tended to decline in dogs aged over 9 year. In particular, a marked decrease was observed in the percentage of those reaching the criterion for defensive ability. Aging has recently been progressing so rapidly in the pet community that an increased concern has been raised about the age-related impaired immune system. Our results confirmed this age-related problem and emphasized the need for an aged dog to undergo regular antibody testing and appropriate vaccination based on the result. The results also demonstrated that the IP test was extremely suitable for examining a large number of samples, for instance, in the case of medical checkup. 3-3. Comparison of IP test and NT in companion dogs The antibody titers were investigated in 50 healthy dogs and 186 suspected cases of CD (107 dogs showed neurological signs and 83 dogs did not). AII the sera that had positive NT titers showed positive IP titers, and all the sera that had negative NT titers showed negative IP titers in the healthy dogs. In contrast, 71.7% and 65.5% of the sera that had negative NT titers showed positive IP titers in the suspected cases of CD with and without neurological signs, respectively. Hence, the IP test was clearly demonstrated as an effective antibody test for the diagnosis of CD. 3-4. Estimation of IP-NT score Furthermore, we examined a possible diagnostic index in terms of the IP titer. The difference between IP and NT titers (IP-NT score) was estimated in the healthy dogs and the suspected cases of CD. The score was indicated as the mean±SD; that is, 0.616±0.385 in the healthy dogs, 1.631±0.834 in the suspected cases of CD with neurological signs and 1.348±0.837 in the suspected cases of CD without neurological signs, resulting in a significantly increased score in the suspected cases of CD (p<0.01). Based on this result, we analyzed the mean±3SD, which 99% of the samples tested are within, and determined the upper limit (mean+3SD) for the healthy dogs as 1.8 of IP-NT score. This upper limit was exceeded in 41.4% of the suspected cases of CD with neurological signs and 31.5% of the suspected cases of CD without neurological signs, indicating that an IP-NT score of > 1.8 is available as one of the diagnostic indices. In a follow-up study conducted on 15 dogs displaying an IP-NT score of > 1.8 at the first examination, 12 of 15 dogs developed neurological signs within one month. These results suggest that the IP-NT score is useful for predicting the onset of neurological signs as well as for diagnosing CD. 4. Application of IP test to CCoV 4-1. Changes in antibody titers in CCoV-experimentally infected SPF dogs When 3 SPF dogs that were inoculated with CCoV, IP and NT titers followed a similar course after the inoculation. 4-2. Comparison of IP test and NT in companion dogs A comparison between the IP test and the NT was performed on 240 healthy dogs and 187 diarrheic dogs (115 dogs aged under one year and 72 dogs aged over one year). All the sera that had negative NT titers showed negative IP titers and all the sera that had positive NT titers showed positive IP titers in the healthy dogs. In contrast, 20.3% and 2.1% of the sera that had negative NT titers showed positive IP titers in the diarrheic dogs aged under one year and aged over one year, respectively. Hence, the IP test should be useful for the diagnosis of CCoV-infection. 4-3. Estimation of IP-NT score The score was indicated as the mean±SD; that is, 0.982±0.447 in the healthy dogs, 2.350±0.931 in the diarrheic dogs aged under one year and 1.404±0.896 in the diarrheic dogs aged over one year, resulting in significantly increased scores in the diarrheic dogs (under one year; p<0.01, over one year; p<0.05). The upper limit (mean+3SD) for the healthy dogs was 2.3 of IP-NT score. This upper limit was exceeded in 57.1% of the diarrheic dogs aged under one year and 24.0% of the diarrheic dogs aged over one year, indicating that an IP-NT score of > 2.3 is available as one of the diagnostic indices for CCoV-infection. 4-4. Prevalence of antibody in companion dogs The percentages of the sera which had positive IP titers were 25.0%, 48.7% and 34.7% in 240 healthy dogs, 115 diarrheic dogs aged under one year and 72 diarrheic dogs aged over one year, respectively. The percentage of the diarrheic dogs under one year of age was significantly higher than that of the healthy dogs (p<0.01), indicating that CCoV contributes to diarrhea in many juvenile dogs. Further analysis was performed to determine the prevalence of CCoV antibody in the diarrheic dogs with or without anti-canine parvovirus (CPV)-IgM antibody. CCoV-antibodies were identified in 38.1% of sera positive for CPV-IgM antibody and in 62.2% of those negative for the IgM, the latter being significantly higher than the former (p<0.05) as well as that in the healthy dogs (p<0.01). This suggests that the antibody test for CCoV should be performed concurrently with that for CPV when diagnosing diarrhea in dogs. 5. Application of IP test to CaHV 5-1. Comparison of IP test and NT in laboratory and companion dogs A comparison between the IP test and the NT was performed on 53 dogs from a CaHV-contaminated laboratory, 590 healthy dogs and 35 dogs with chronically respiratory signs. In these animals, all the sera that had positive NT titers showed positive IP titers; however, 23.8%, 0.5% and 3.5% of each group, which had negative NT titers, showed positive IP titers, implying that the IP test detects the antibody more accurately than the NT. The results indicate that the IP test is highly applicable to the serodiagnosis of CaHV-infection. 5-2. Estimation of IP-NT score The IP-NT score was indicated as the mean±SD; that is, 1.280±0.520 in the laboratory dogs, 1.220±0.441 in the healthy dogs and 1.106±0.334 in the dogs with respiratory signs. There were no significant differences among the laboratory dogs, the healthy dogs and the dogs with respiratory signs. 5-3. Prevalence of antibody in companion dogs Investigation of CaHV-antibody in sera from 590 healthy dogs demonstrated an extremely low prevalence, that is, 3.1%. However, the prevalence in 35 dogs with chronically respiratory signs was estimated to be 20.0%, and was significantly higher than that of the healthy dogs (p<0.01). The result was consistent with a general tendency concerning the relationships between CaHV and respiratory diseases. 6. Prevalence of antibody in multi-dog households Additionally, we analyzed the prevalence of CCoV- and CaHV-antibody in mass-breeding environments. CCoV-antibodies were identified in 100%, 100%, 90.0%, 0% and 0% of the respective samples from 5 breeding facilities; the percentages in the 3 facilities exceeded that of the healthy dogs (p<0.01). CaHV-antibodies were identified in 100%, 69.8%, 0% and 0% of the respective samples from 4 breeding facilities; the percentages in the 2 facilities exceeded that of the healthy dogs (p<0.01). These results imply that once CCoV and CaHV contaminate a mass-breeding facility, they spread extensively and the antibodies are detected in a considerable percentage of animals. Therefore, prior to the transportation and intermixing of dog populations, CCoV- and CaHV-infections should be examined using the IP test. In this study, the IP test was used for the first time to diagnose canine virus infections, indicating its high specificity as well as simplicity and rapidity compared to those of the conventional NT and ELISA. We established a useful diagnostic method for CDV and CCoV infections using a combination of IP test and NT. No such information has previously been reported. Furthermore, we demonstrated the prevalence of the CDV-, CCoV- and CaHV-antibodies in the pet population, which has not previously been thoroughly investigated in Japan. Taken together, these results suggest that the IP test is highly applicable to the diagnosis of canine virus infections. |
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| 学位名 | ||||||||
| 学位名 | 博士(獣医学) | |||||||
| 学位授与機関 | ||||||||
| 学位授与機関名 | 麻布大学 | |||||||
| 学位授与年月日 | ||||||||
| 学位授与年月日 | 2001-11-26 | |||||||
| 学位授与番号 | ||||||||
| 学位授与番号 | 乙第392号 | |||||||
| 著者版フラグ | ||||||||
| 出版タイプ | AM | |||||||
| 出版タイプResource | http://purl.org/coar/version/c_ab4af688f83e57aa | |||||||
