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アイテム
緑膿菌感染症の治療に関する基礎的研究 : 細菌学的見地からみた抗生物質の新しい投与方法
https://az.repo.nii.ac.jp/records/3186
https://az.repo.nii.ac.jp/records/31865bf3af7c-8c10-423a-a952-ac87dd0a38b6
| 名前 / ファイル | ライセンス | アクション |
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diss_dv_otsu0213 (3.1 MB)
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| Item type | 学位論文 / Thesis or Dissertation(1) | |||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 公開日 | 2013-01-29 | |||||||||
| タイトル | ||||||||||
| タイトル | 緑膿菌感染症の治療に関する基礎的研究 : 細菌学的見地からみた抗生物質の新しい投与方法 | |||||||||
| タイトル | ||||||||||
| タイトル | Basic studies on the treatment against Pseudomonas aeruginosa infection : a new combined treatment of antibiotics from bacteriologicai viewpoint | |||||||||
| 言語 | en | |||||||||
| 言語 | ||||||||||
| 言語 | jpn | |||||||||
| 資源タイプ | ||||||||||
| 資源タイプ | thesis | |||||||||
| 著者 |
笠井, 隆夫
× 笠井, 隆夫
× Kasai, Takao
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| 抄録 | ||||||||||
| 内容記述タイプ | Abstract | |||||||||
| 内容記述 | 緑膿菌は自然界に広く分布・生息し，比較的病原性の弱い菌とされているが，獣医学領域では特にミンクの出血性肺炎，牛の乳房炎，犬の外耳道炎，ヒナの敗血症の原因として知られ，人医学領域では慢性呼吸器感染症・慢性尿路感染症・骨膜炎などをおこすことが問題となっている。本菌による感染・発症は一般に宿主側抵抗力の減弱化にともなっておこる場合が多く，さらに抗菌剤の使用に基づく菌交代症または二次感染症として発症することが多い。 緑膿菌は各種抗生物質に対して自然耐性であることから，この感染は難治性の疾患の1つに加えられている。それでも，カルベニシリンなどのβ-ラクタム抗生物質は比較的良好な抗菌性を示すことから，近年，臨床上で実施応用されるに至った。 山本・本間らは，EDTA・リゾチームで前処理した緑膿菌をカルベニシリン(CBPC)含有のショ糖加高張培地で嫌気的に培養することによってL型菌を高率に検出し，さらに，継代培養することによって液体培地において安定的に増殖可能なL型菌を分離した。このL型菌は親株に比較して抗生物質に対する感受性が著しい差異を示すものであった。すなわち，緑膿菌のL型は多くのβ-ラクタム系抗生物質に対して全く感受性を示さないのみならず，現在，臨床上応用されているアミノグルコシド系抗生物質およびペプチド系抗生物質に対しても感受性の低下をきたしていることを認めた。このことは緑膿菌に対して最も有効とされている抗生物質がL型菌に無効であることを示すものであった。一方，これとは逆に，親株には全く無効であるマクロライド系抗生物質に対して，L型菌は著しく感受性を増していることが明らかにされた。この事実は，従来，化学療法剤の選択を親株の感受性に基づいておこなってきたことに対して警告を発しているものと考えられる。 また，山本・本間らは，緑膿菌感染症の中でも予後不良とされているヒトの慢性呼吸器感染症・慢性尿路感染症およびウシの乳房炎における抗生物質での治療中に詳細な菌検索を実施し，緑膿菌の正常栄養形(親株)と共に不安定な正型菌を高頻度に分離した。このL型菌は抗生物質の投与を中止すると容易に親株に復帰するものであった。このことは，β-ラクタム系抗生物質による緑膿菌感染症の治療時にも生体内緑膿菌がL型やスフェロブラストに変換していることを示唆している。そして，このL型菌やスフェロプラストへの変換は緑膿菌感染症が極めて難治性であることの一つの理由であると思考される。 そこで，本研究では緑膿菌感染症に対する有効な治療方法を確立することを目的として検討してきた。ポリミキシンB(PL)，コリスチン(CL)およびジベカシン(DKB)はグラム陰性桿菌の細胞壁に作用して細飽壁に亀裂を作ること，またCBPCおよびホスホマイシン(FOM)はペプチドグリカンに作用して細飽壁合成を阻害することが知られている。本論文ではこれら抗生物質を細飽壁障害性抗生物質と仮称し，これらとマクロライド系抗生物質を併用すると，緑膿菌はL型に変換してマクロライド系抗生物質で殺菌されることを明らかにした。またL型菌への変換がおこらない場合でも細胞壁に亀裂等の障害が与えられれば，マクロライド系抗生物質が菌体内に取り込まれ，併用効果が現われることも報告している。そこで，この併用効果の作用機序についても解析を試みた。マクロライド系抗生物質としては，ミデカマイシン(MDM)とその誘導体のミデカマイシンアセテート(MOM)を使用した。 1. 試験管内の緑膿菌に対する抗生物質の影響 EDTAは緑膿菌の細胞壁外膜に障害を与えることが明らかにされている。緑膿菌を0.5Mのショ糖で浸透圧を保持したトリス緩衝液中で，5mMEDTAを作用させ，この菌液をショ糖を加えた高張培地に塗布して，ディスク法で種々の抗生物質に対する感受性の変化を調べた。その結果，EDTAで処理した場合は，未処理のものがMDMおよびMOM等のマクロライド抗生物質含有ディスクで阻止帯を形成しなかったのに比べ，明瞭な阻止帯が形成され，マクロライド抗生物質に感受性を示した。そこで抗生物質で処理した場合も同様の現象がみられるかどうか検討した。高張培地中で対数増殖期まで増殖した緑膿菌にFOMを加え，スフェロプラストとした後，同様の方法で，マクロライド抗生物質に対する感受性を調べた。この場合もMDMおよびMOM等のマクロライド抗生物質含有ディスクで，阻止帯が形成された。 次に生菌数を測定して，詳細に検討を行なった。高張培地で緑膿菌を対数増殖期まで培養し，CBPCを加え更に培養を続け，スフェロプラストを形成した時点でMDMまたはMOMを加えた。以後経時的に試料を取り出し，生菌数を測定した。生菌数の測定は，高張培地を用いて行なった。その結果，マクロライド単剤では生菌数の減少は認められず，増殖は抗生物質無添加のものと一致していた。これに比べ，CBPCとMDMまたはMOMを加えた場合は，CBPC単剤に比べ，明らかに生菌数が減少した。同様の方法で，FOMとMOM，PLとMOM，CLとMOMおよびDKBとMDMについて行なった。この場合は，高張培地を使用せず，普通培地で行なった。その結果，これらの抗生物質においても，単剤に比べ，2剤併用した方が，著明に生菌数が減少した。以上あことから，試験管内において，緑膿菌をスフェロプラストまたは，スフェロプラストに至らなくても細胞壁に亀裂を生じさせた場合は，マクロライド抗生物質と細胞壁障害性抗生物質が殺菌的に作用し，併用効果を示すことが明らかとなった。 そこで，これら抗生物質の併用効果を ^<14>C-標識MOMを用いて解析した。まずマクロライド抗生物質に対して著るしい感受性を示す緑膿菌のL型菌への，^<14>C-MOMの取り込みを親株と比較した。高張培地で増殖した対数期のL型菌(約10^8 cells/ml)に ^<14>C-MOM溶解液(5×10^4 cpm/ml)を加え，37℃で振盪培養し，経時的に菌液を取り出し，ショ糖加トリス乾衝液で2回菌体を遠心により洗滌し，この菌体の放射能活性を測定した。L型菌においては，放射能活性は30分で定常となり，120分まで同じ活性を維持した。これに比べ，親株ではほとんど放射能活性は認められなかった。 次に細胞壁障害性抗生物質で緑膿菌を処理した場合も，L型菌同様に ^<14>C-MOMの取り込みが認められるかどうか検討した。まず，PLおよびFOMの処理濃度と ^<14>C-MOMの取り込みの関係を調べた。高張培地で培養した緑膿菌に種々の濃度の抗生物質を加え，一定時間培養した。そしてこの菌体を集菌して同じ濃度の抗生物質を含む高張培地に浮遊し，高張培地で調整した ^<14>C-MOM(5×10^4 cpm/ml)を加え，更に37℃で一定時間反応させた後，菌体をショ糖加トリス緩衝液で2回遠心して洗滌し，放射能活性を測定した。PLの場合は3.13単位U/ml以上の濃度で，またFOMは，0.39μg/ml以上の濃度で処理した時，^<14>C-MOMの取り込みが認められ，この取り込みは，処理濃度に依存して直線的に上昇した。 そこで，PL，FOMその他CBPC，DKBで前処理した菌体への ^<14>C-MOMの経時的取り込みを調べた。PL，FOM，CBPC，DKBをそれぞれ 50U/ml,1000μg/ml，500μg/mlおよび3.13μg/mlで前処理し，^<14>C-MOMと反応させ，経時的に菌体の放射能活性を測定した。いずれの抗生物質の場合でも，10～20分で取り込みは定常に達し，60分でもほぼ同じ値を維持した。FOMで前処理した場合は，60分まで放射能活性は除々に上昇する傾向を示した。 マクロライド抗生物質は一般にリボソームに結合して作用することが明らかになっているので，菌体内に取り込まれた ^<14>C-MOMがリボソームに分布するか検討した。^<14>C-MOMを取り込んだ菌体をトリス緩衝液に浮遊し，溶菌緩衝液(デオキシリボヌクレアーゼおよびBriJ-58含有)を加え，菌体を溶菌させ，その遠心上清をショ糖密度勾配にのせ，遠心して解析した。その結果，細胞壁障害性抗生物質で前処理した場合は，260nmの吸光度のピークと放射能活性の画分は一致して認められ，この画分は，リボソームの位置を確認するために置いた大腸菌70Sリボソームの位置に一致していた。この実験結果は，緑膿菌を細胞壁障害性抗生物質で処理した場合，^<14>C-MOMは70Sリボソームに取り込まれたことを示している。 そこで50Sリボソームおよび30Sリボソームのいずれのリボソームサムユニットに，^<14>C-MOMが結合して作用するか，更に検討した。細胞壁障害性抗生物質で前処理して ^<14>C-MOMを取り込んだ緑膿菌体から常法により70Sリボソームを分離した。そして分離したリボソームを10mMの塩化マグネシウムを含む0.4～1.3Mのショ糖密度勾配および1mMの酢酸マグネシウムを含む0.15～0.6Mのショ糖密度勾配にのせて，それぞれ240,000×gで50分および190,000×gで120分間それぞれ遠心した。10mMの高マグネシウム存在下で遠心した場合は，サブユニットに解離しなかったが，1mMの低マグネシウム存在下では，50Sサブユニットと30Sサブユニットに解離し，放射能活性は50Sサブユニットに認められた。 2. マウス生体内における感染緑膿菌に対する抗生物質の効果 In vitroで細胞壁障害性抗生物質とマクロライド抗生物質が併用効果を示したので，in vivoにおいても同様の効果が現われるかどうか，種々のマウス緑膿菌感染モデルを用いて検討した。動物は，ddyまたはICRの4～6週令の雌マウスを使用した。緑膿菌感染モデルとしては，腹腔内感染，1%カラギーナン溶液による皮下感染およびHolderらの火傷感染モデルを用いた。緑膿菌を感染させたマウスに，細胞壁障害性抗生物質を皮下または筋肉内に1回または数回反復投与し，同じ回数のマクロライド抗生物質を経口投与した。マクロライド抗生物質のMDMは，0.5%アラビアゴム溶液に，MOMは0.5%ハイドロキシメチルセルロース溶液にそれぞれ懸濁して投与した。その結果，マクロライド抗生物質単剤投与群は，菌接種後1～3日目に全例が死亡した。これに比べて，マクロライドとPL，CL，CBPC，FOMあるいはDKBの2種類の抗生物質を投与した群は，細胞壁障害性抗生物質単剤投与群に比べ，生存率が上昇した。Fisherの直接確率計算法でこれら2種類の抗生物質投与群の生存率と細胞壁障害性抗生物質のみの投与群の生存率を比較すると，明らかに併用効果が認められ(P<0.05)。このin vivoの実験を17回繰り返して行なったが，すべての場合で，細胞壁障害性抗生物質とマクロライド抗生物質との間に併用効果が認められた。またマクロライド抗生物質の1回当りの投与量は，きわめて少ない量でも効果的に作用することが，明らかとなった。 前述の研究結果より，緑膿菌に対してマクロライド抗生物質と細胞壁障害性抗生物質を併用すると，マクロライド抗生物質が菌体内に取り込まれ，緑膿菌リボソームの50Sサブユニットに結合して蛋白合成を阻害し，in vitroにおいては生菌数を減少させ，in vivoにおいては，緑膿菌感染マウスの生存率を上昇させることが証明された。今日，抗菌力の増強を主眼に各種抗生物質の併用による治療が行なわれているが，このような併用は今迄に報告がない。従って緑膿菌感染症の治療に汎用されているβ-ラクタム系抗生物質，アミノグルコシド系抗生物質およびペプチド系抗生物質のいずれかと，マクロライド抗生物質を併用して治療を行なえば，緑膿菌を殺菌するとともに，慢性感染症の原因の一つと考えられているL型菌を殺し，従来以上の治療効果が期待できるものと考える。 |
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| Abstract | ||||||||||
| 内容記述タイプ | Other | |||||||||
| 内容記述 | Yamamoto and Homma isolated some unstable L-form strains possessing different characteristics from P. aeruginosa strains treated with Iysozyme-EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid) and cultured anaerobically on osmolized agar plates containing carbenicillin (CBPC). They obtained stable L-forms which grew in liquid media without CBPC after serial passage of the unstable L-forms to CBPC-free media. They found that there was remarkably different antibiotic susceptibility between the L-form and its parental bacillary form. β-lactam antibiotics became completely ineffective against L-forms. On the other hand, aminoglycoside as well as peptide antibiotics used clinically against infection due to P. aeruginosa became far less effective against L-forms than their parent bacilli. These facts indicate that most antibiotics which are being used for treatment of pseudomonal infection show loss of activity against L-forms. To the contrary, it is confirmed that macrolide antibiotics which are usually ineffective against parent strains of P. aeruginosa become remarkably effective against their L-forms. Yamamoto and Homma also reported that parent baciilary forms as well as unstable L-forms of P. aeruginosa were more frequently isolated from clinical specimens such as sputum, urine of patients with chronic respiratory tract infection, chronic urinary tract infection and milk of cows with mastitis due to P. aeruginosa being treated with β-lactam antibiotics. The L-Forms could easily be reverted to their parent bacillary forms in patients who had stopped β-lactam antibiotic therapy, because unstable L-forms induced by CBPC easily reverted to their parent forms when transferred to L-form media containing no antibiotic. It is presumed that in the case of treatment with β-lactam antibiotics against pseudomonal infection, these drugs convert the bacterium to unstable L-forms and/or spheroplasts. It has been postulated that their revertants may be responsible for the persistance of infection. From the above considerations, the purpose of the present studies is to find effective methods of chemotherapy for pseudomonal infection. It was proved that polymyxin B (PL), colistin (CL) and dibekacin (DKB) cause fissure in the cell wall of gram-negative rods, and that CBPC and fosfomycin (FOM) inhibit the mucopeptide layer of gram-negative rods. For the above reasons, PL, CL, DKB, CBPC and FOM have tentatively been called cell wall-affecting antibiotics. In this study the auther attemped to discover whether injury to the cell wall makes this organism sensitive to macrolide antibiotics even though such cellular damage does not result in induction of L-forms or spheroplasts. The mechanisms involved in the combined use of macrolide and cell wall-affecting antibiotics are also analyzed. Midecamycin (MDM) and its derivative, midecamycin acetate (MOM) were used as the macrolide antibiotics. The results are summarized below. (1) It was proved that EDTA acts on the outer membrane of the cell wall of P. aeruginosa. The cells of P. aeruginosa were added to Tris-HCl buffer including 0.5 mM EDTA and 20% sucrose. Samples were spread on osmolized agar medium containing 20% sucrose and susceptibility to antibiotics determined by disc method. In the case of treatment with EDTA, an inhibition zone appeared around the disc containing the macrolide antibiotic MDM or MOM. However, in non-treatment with EDTA, an inhibition zone did not appear. Antibiotic susceptibility tests were conducted using cells treated with antibiotic. At the logarithmic growth phase, FOM was added to the culture containing 20% sucrose and cells were incubated for indicated times. Susceptibility of spheroplasts induced by FOM to macrolide antibiotics were examined in the same manner. In this experiment, inhibition zones also appeared around the discs containing the macrolide antibiotic. (2) Synergistics of the cell wall-affecting and macrolide antibiotics were evaluated by estimating the number of viable cells. Cells of P. aeruginosa were culture in Brain Heart Infusion broth supplemented with 0.5 M sucrose. At the logarithmic growth phase, CBPC was added to the culture and incubated for indicated times. When almost all bacteria became spheroplasts, MDM or MOM was added and the number of viable cells determined by estimating the number of colony forming units on media which proved to have sufficient osmotic supporte at varying intervals. In the case of MDM or MOM alone, no reduction in viable cells was observed. This was similar to the phenomenon observed in the controls which had not been treated with antibiotics. However, the number of viable organisms after the addition of both kinds of antibiotic decreased remarkably. Similar synergistic bactericidal effects on P. aeruginosa were also observed for FOM with MOM, PL with MOM, CL with MOM and DKB with MDM. For the evaluation of the combined action of these antibiotics, non-osmolized media with sucrose were used. (3) Combined effects of cell wall-affecting antibiotics and a macrolide antibiotic against P. aeruginosa were analyzed using ^14 C-MOM. First, incorporation of ^14 C-MOM into L-form cells which is more susceptible to the macrolide antibiotic was compared to incorporation into parent form cells. ^14 C-MOM solution was added to logarithmic phase cells of L-forms or the parent bacteria suspended in medium supplemented with sucrose and incubated. Samples were taken from the culture at intervals. The L-form cells were washed twice with solution proving sfficient osmotic support. The radioactivity of cells were estimated by liquid scintillation counter. Radioactivity of L-form cells was found to increase for 30 min then retain the same level until 120 min, while radioactivity of the parent cells was almost negligible. (4) Incorporation of ^14 C-MOM into parental cells pretreated with the cell wall-affecting antibiotics was examined using the same method. Bacterial cells were incubated with PL or FOM for indicated times in the medium containing the series of concentrations of PL or FOM and then incubated with ^14 C-MOM and radioactivity was counted after washing by centrifugation. Radioactivity of ^14 C-MOM incorporated into the bacterial cells increased linearly with concentrations of PL. Similarly, in the case of FOM, radioactivity of ^14 C-MOM incorporated into the bacterial cells was found to increase linearly with concentration of FOM. Next, the time course of incorporation of ^14 C-MOM into bacterial cells pretreated with the cell wall-affecting antibiotic was examined. PL, CBPC, DKB and FOM were incubated at the concentration of 50 U/ml, 500 μg/lml, 3.13 μg/ml and 1,000 μg/ml respectively for indicated times. The bacterial cells treated with the antibiotics appeared to incorporate ^14 C-MOM efficiently : In the case of PL, e CBPC and DKB, radioactivity increased 10-20 min after addition of ^14 C-MOM and retained the same level for 60 min. As for FOM, the radioactivity increased rapidly until 10 min and at a slow rate until at least 60 min after addition of isotope. It is significant that the bacterial cells which had not been treated with any of the antibiotics did not incorporate any ^14 C-MOM. (5) It is confirmed that a macrolide antibiotic generally bineds to ribosomes in bacterial cells to exhibit antibacterial activity. Thus ^14 C-MOM incorporated into P. aeruginosa cells pretreated with cell wall-affecting antibiotic was examined to observed whether ^14 C-MOM is detected in ribosome. The bacterial cells which had incorporated ^14 C-MOM were suspended in Tris-HCl buffer to which an equal volume of lytic buffer (containing Mg^++, DNase and Brij-58) was added. The supernatant of the lysate was laid on linear sucrose gradient. The gradient was subjected to centrifugation for the indicated time. In all cases tested (pretreated with one of four antibiotics, PL, CBPC, DKB and FOM) the maximum adsorption peak of 260 nm and maximum radioactivity peak were observed in the same position where 70 S ribosomes of E. coli migrated. These results suggest that ^14 C-MOM binds with 70 S ribosome of P. aeruginosa if the cells have been treated with cell wall-affecting antibiotics. Next, it was investigated whether ^14 C-MOM binds to either 30 S or 50 S ribosome of P. aeruginosa. The ribosome was prepared from bacterial cells of P. aeruginosa which had been incubated with CBPC and ^14 C-MOM according to the method previously described. A portion of the purified ribosomes were laid on 0.4 M to 1.3 M linear sucrose density gradient containing 10 mM Mg^++ and centrifuged. Radioactivity was found to migrate to where 70 S ribosomes migrated. Using 0.15 M to 0.6 M linear sucrose density gradient containing 1 mM Mg^++, 70 S ribosomes were dissociated into 50 S and 30 S subunits. The radioactivity was found to migrate to where 50 S ribosomal subunits migrated. No radioactivity was found by the 30 S ribosomal subunits. (6) As synergistic effects between macrolide and cell wall-affecting antibiotic against P. aeruginosa were observed in vitro, in vivo experiments were performed using various mouse infectio models. Intraperitoneal infection, subcutaneous infection with carrageenan solution and burn infection models were used. Both ICR and ddY, 4-6 weeks old, female mice were used. MOM and MDM were suspended in 0.5% hydroxylpropylmethyl cellulose solution and 0.5% gum arabic solution respectively. Each mouse infected by P. aeruginosa was intramuscularly or subcutaneously given the cell wall-affecting antibiotic and at the same time orally given the macrolide antibiotic. In the case of single treatment by only one of the two kinds of antibiotics, all mice died within 1 or 2 days. In contrast, combined treatment using a macrolide plus one of the antibiotics, PL, CL, DKB, CBPC or FOM, prevented death in a high percentage of the infected mice. All 17 experiments indicated that the combined treatment was statistically (Fisher's exact method) more effective than single treatment by only one of the two kinds of antibiotics. These results provide evidence that P. aeruginosa cells incorporate MDM or MOM when the bacterial cells are exposed to cell wall-affecting antibiotics such as PL, CL, DKB, CBPC and FOM. Protein synthesis is thus inhibited by the macrolides because the macrolide bind 50 S ribosome subunits of P. aeruginosa. From these experiments the combined action of a macrolide and a cell wall-affecting antibiotic has been proved in vitro as increasing bactericidal action as well as in vivo increasing survival rates of mice infected with P. aeruginosa. Chemotherapy against chronic infection due to P. aeruginosa must take consideration the ecological fact that conversion of P. aeruginosa into L-forms is associated with remarkable alteration in the drug susceptibility of this organism. |
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| 学位名 | ||||||||||
| 学位名 | 獣医学博士 | |||||||||
| 学位授与機関 | ||||||||||
| 学位授与機関名 | 麻布大学 | |||||||||
| 学位授与年月日 | ||||||||||
| 学位授与年月日 | 1983-06-01 | |||||||||
| 学位授与番号 | ||||||||||
| 学位授与番号 | 乙第213号 | |||||||||
| 著者版フラグ | ||||||||||
| 出版タイプ | AM | |||||||||
| 出版タイプResource | http://purl.org/coar/version/c_ab4af688f83e57aa | |||||||||
