@misc{oai:az.repo.nii.ac.jp:00003150,
 author = {増田, 高志 and Masuda, Takashi},
 month = {2013-06-20, 2014-08-18},
 note = {Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7(-):(EHEC O157) [also called Verocytotoxin-producing Escherichia coli:(VTEC) or Shiga toxin-producing Escherichia coli:(STEC)] was first identified in an outbreak caused by undercooked hamburger at same fast food restaurant chain in Oregon and Michigan(USA) in 1982. EHEC O157 infection has became a worldwide sirious problem.
 In Japan, the first outbreak of this pathogen occurred at kindergarten in Urawa city(Saitama prefecture) in 1990. Since May 1996, outbreaks and sporadic cases have increased. In July 1996, big outbreaks(cases-5,727, deaths-3) occurred at primary school in Sakai city(Osaka prefecture). According to the reports by the Ministry of Health and Welfare, total reported cases of EHEC O157 infection numbred 9,451, hospitalized 1,808 and deaths 12 in 1996.
 In USA, Canada, United Kingdom, EHEC O157 was isolated specimens of hamburger(minced beef), roast beef, raw milk, vegetables. Therefor, cattle are suspected to be one of the most singnificant sources of EHEC O157.
 In Japan, EHEC O157 was isolated specimens of radish sprouts(Kaiware daikon), okaka salad, potato salad. In epidemiologcal investigation, beef have been suspected for the source of diffuse outbreaks. But rapid and accurate methods for the isolation of EHEC O157 is not established yet. And also in Japan, EHEC O157 isolates were hardly analyzed by the phage typing scheme for epidemiological investigations.
 This study has evaluated that phage types of EHEC O157 isolated from human and cattle, effects of pH, sodium chloride(NaCl) cocentration and temprature on the growth of EHEC O157, methods for isolation of EHEC O157 from commercial foods(meats and vegetables), methods for isolation of freeze-injured EHEC O157 from vegetables, and EHEC O157 contamination in food and water samples in Shizuoka prefecture.

1. Phage types of EHEC O157 isolated from human and cattle
 From 1987 to 2000, a total of 545 EHEC O157 strains(170 from human feces and 375 from cattle sources) collected were submitted for phage typing and others(serotyping, VT typing, drug resistance).
 Of these, 508 strains (162 from human and 346 from cattle) were phage typed. In human strains, 21 different phage types(PT1, 2, 4, 8, 14, 21, 23, 24, 28, 31, 32, 33, 34, 37, 41, 45, 49, 54, 56, 61, 72) were identified. And in cattle strains, 22 different phage types (PTI, 2, 4, 8, 14, 21, 23, 31, 32, 33, 34, 39, 40, 43, 45, 54, 56, 63, 67, 71, 74, 78) were also identified. Predominant phage types were PT2(16.5%), 32(14.7%), 4 and 21(10.6%) in human strains, PT34(18.1%), 54(16.3%), 39(10.9%), 23(8.8%) in cattle strains. Fourteen phage types(PT1, 2, 4, 8, 14, 21, 23, 31, 32, 33, 34, 45, 54, 56) were common in both sources. Phage types of strains isolated from the same outbreaks(group or family) were the same. 
 These result suggest that the phage typing scheme isuseful in the studying causative factors in epidemiological investigations.

2. Effects of pH, sodium chloride cocentration(NaCl) and temprature on the growth of EHEC O157.
 Effects of pH(3.0-11.0), NaCl(0.5-10.0%) and temperature (5.0-48.0℃) in TSB on the growth of EHEC O157 were examined. Growth of EHEC O157 occurred 4.5<pH<9.0 or 9.5,between 25℃ and 44.5℃. After 35℃-24hr enrichment at 6.0% NaCl, there was no EHEC O157 detected.
 These result suggest that EHEC O157 survive in sea water and seafoods except salmon roe result the food poisoning-causative foods.
 EC medium for isolition of Escherichia coli are incubated at 44.5℃ as the official method by Ministry of Welfare. But in this temperature, EHEC O157 cannot be grown. Therefore, for isolation of EHEC O157 from foods, 42℃ enrichment in modified EC broth with novobiocin is the useful method.

3. Evalution of methods for isolation EHEC O157 from commercial Foods(meats and vegetables)
 This study has evaluated methods for isolation and idenfication of EHEC O157 inocurated into minced beef and radish sprouts(chilled and freezed), i.e., 42℃•24hr enrichment in modified EC broth with novobiocin(NmEC), or 35℃•24hr enrichment in tryptic soy broth(TSB) followed by planting onto sorbitol MacConkey agar(SMAC), SMAC with cefixime-tellurite(CT-SMAC), CHROM ager O157(CHR), BCM O157 agar(BCM), or immunomagnetic separation(IMS) followed by planting onto these four same media.
 The isolation and idenfication of EHEC O157 was better on CT-SMAC than SMAC. CHR and BCM were as good as CT-SMAC. Using CT-SMAC and CHR or BCM together was of importance. Then 42℃•24hr enrichment in NmEC was better than 35℃•24hr enrichment in TSB.
 These result suggest that using 42℃•24hr enrichment in NmEC, followed by IMS and inocuration onto CT-SMAC and CHR or BCM was the most useful method.
 Also rapid immunochromatographic assay(Now O157, PATH-STIK, VIP) were of use for screening test of EHEC O157. But it was necessary to take care of using these assay because these assay somemtimes showed false-positive reaction.

4. Evalution of methods for isolation of freeze-injured EHEC O157 from vegetables
 This study has evaluated methods for isolation and idenfication of freeze-injured EHEC O157 inocurated into radish sprouts, strawberry, salted cabbage.
 Incubation in mEC without novobiocin and bile salts at 25℃ for 2hr followed at 42℃ for 18hr with addition of novobiocin and bile salts gave good recovery of freeze-injured EHEC O157 from vegetables.
 And the incubation at 25℃ for 2hr in non-selective broth was good for the recovery of freeze-injured EHEC O157 from freezen strawberry and salted cabbage.

5. EHEC O157 contamination in food and water samples in Shizuoka prefecture
 From 1996 to 2000,EHEC O157 contamination in 546 food samples(333 meats, 191 vegetables and 22 others) and 149 water samples(sea, sewage, etc) in Shizuoka prefecture were Investigated.
 EHEC O157 was not detected from these 695 samples.
 These result suggest that EHEC O157 contamination ratio of commercal foods in Shizuoka prefecture is low.

The results of this study obtained as follows:
 1)The phage typing scheme is useful in the studying causative factors in epidemiological investigations. But the combined use of phage typing and molecular biological method(pulsed-field gel electrophoresis) can provide a more detailed classification of EHEC O157.
 2)Effects of pH,NaCl and temperature on the growth of EHEC O157 were examined.
 The results suggested the possibility for the control of growth of EHEC O157 in foods.
 3)In evalution of methods for isolation of EHEC O157 from commercial foods(meats and vegetables) and of freeze-inured EHEC O157 from vegetables, the useful method would be confirmed., 腸管出血性大腸菌O157:H7(-)(以下、EHEC O157)は、1977年にKonowalchukらによりその存在が明らかにされ、1982年に米国の同一チェーン店のレストランで販売されたハンバーガーを原因食品として発生した集団下痢症の起因菌として世界的に注目されるようになった。
　わが国でも、1996年に本菌による集団食中毒事件が全国的に多発し、現在では、本感染症は全世界的に重大な問題となっている。
　本感染症の原因食品として、諸外国では牛肉類、生乳、生野菜など、わが国ではカイワレ大根、おかかサラダ、ポテトサラダといった野菜類が報告されている。近年、牛ステーキやたたきによる集団的散発事例(diffuse outbreak)もあり、感染源として牛の関わりが強く示唆されている。しかし、わが国では原因菌が分離されず原因食品や感染源が特定されない事件が多く、食肉、野菜などからの原因菌の確実な分離法の確立が望まれている。また、ヒトや牛から分離されたEHEC O157について疫学的解析を行うことはその発生防止対策の上で重要でありファージ型別については、わが国ではあまり実施されていない。
　そこで、本研究では、1.ヒトおよび牛由来EHEC O157の疫学マーカーの検討、2.物理的条件下におけるEHEC O157の増殖性の検討、3.食品からのEHEC O157分離法の検討、4.野菜からの凍結損傷EHEC O157分離法の検討、5.食品および環境水などのEHEC O157の汚染状況調査を行った。

1.　ヒトおよび牛由来EHEC O157の疫学マーカーの検討
　細菌の疫学マーカーは感染症や食中毒の感染源を追求するのに不可欠な検査であり微生物の表現型(フェノタイプ)のマーカーとして、生物型、血清型、ファージ型、薬剤感受性などが用いられてきた。
　静岡県のヒト由来株の血清型は、87.6%がO157:H7、VT型は61.2%がVT1, 2であったのに対して、牛由来株の血清型は95.2%がO157:H7、VT型は58.1%がVT2であり、両由来株間で産生する主なVT型が異なった。また、薬剤感受性では、ヒトおよび牛由来株ともにストレプトマイシン、テトラサイクリン耐性化が進んでいることが注目され、アンピシリン、ナリジクス酸、カナマイシン、クロラムフェニコ一ルの耐性株がみられたことや少数ではあるが5剤耐性を示した株があった。これらの成績から血清型別、VT型別、薬剤感受性は疫学マーカーとして有用であるが、分離株間の識別力が乏しく疫学的解析には不十分であった。
　そこで、ヒトおよび牛由来株のファージ型について試験した。その結果、ヒト由来株では2、32、4、21型、牛由来では34、54、39、14、23型が多く分離され、両由来株の主要なファージ型は異なっていた。しかし、8、14、21、32、34、54型などがヒトおよび牛由来株に共通して比較的多く分離されていることからこれらが牛からヒトへの主な感染型と推察された。今回試験したヒトおよび牛由来のファージ型は、過去の内外の報告とほぼ一致していたが、ヒトのみあるいは牛のみにみられるものがあり、両由来株のファージ型に若干の差がみられ、ヒトへの感染源は牛のみでなく他の要因の関与も考えられた。また、特定のファージ型とVT産生に関連性があるものが存在した。さらに、同じ集団感染例や家族内感染例からの分離株はすべて同じファージ型であった。
　以上のことから、ファージ型別は分離株間の識別が可能で疫学マーカーとして有用であることが示唆された。

2.　物理的条件下におけるEHEC O157の増殖性の検討
　食中毒の予防対策の上で、各種物理的条件による食品中のEHEC O157の増殖性を把握し、これらを活用することにより微生物制御することが可能と考え、培地のpH、塩分濃度および培養温度といった物理的条件の違いによってEHEC O157の増殖性に差があるのか基礎的な検討を行った。
　今回の成績から、pH4.0以下の酸性食品やpH10.5以上のアルカリ性の状態ではEHEC O157の増殖は阻害されるため、有機酸などを食品に添加して、食品の特性を失わない程度にpHを調整することは有効な食品の保存法であり、これにより食品の安全性が確保できるものと考えられた。また、EHEC O157は海水中でも充分生存できることが判明し、イクラのみならず他の海産物も食中毒の原因食品になり得る可能性が示唆された。さらに、食品衛生法におけるEC培地を用いた大腸菌検査では、培養温度は44.5℃と規定されているが、この温度ではEHEC O157は増殖が抑制されるため、増殖に適した培養温度とは言えない。現在、食品からのEHEC O157検査における増菌法として、42±0.5℃で培養する方法が一般的であり、この温度は他の細菌の増殖をある程度抑制することから適当な方法と考えられた。

3.　食品からのEHEC O157分離法の検討
　食中毒事件の推定原因食品(牛挽肉およびカイワレ大根)からのEHEC O157分離法における直接法と免疫磁気分離法(IMS法)、分離培地、増菌培地による分離の比較およびイムノキットの比較について検討した。
　その結果、IMS法は直接法より分離感度において優れており、EHEC O157の分離に有効な方法であった。特に、カイワレ大根において直接法で分離できなかった検体がIMS法により分離できた。ただし、IMS法は高感度な方法であるため検体間の菌混入や誤った操作により間違った結果となる可能性があることから多検体を一度に扱う場合などは十分な注意が必要であった。
　分離培地の検討では、セフィキシム亜テルル酸カリウム加ソルビトールマッコンキー培地(CT-SMAC)は添加されているCTにより強い選択性がみられ、釣菌しやすいことから全体的に高い分離率を示した。また、クロモアガーO157(CHR)やBCM O157(BCM)などの酵素基質培地もCT-SMACとほぼ同等の分離感度であり、今回の実験において、酵素基質培地のみで分離された検体もあったことからCT-SMACと酵素基質培地を併用することにより分離率を上げることが可能と考えられた。
　増菌培養地の検討では、トリプトソイブロスのように抑制力のない栄養豊かな培地では様々な菌が増殖して、目的とするEHEC O157の発育が抑制されるため、ノボビオシン加mEC培地による培養法が優れていた。しかし、検査する食品の条件(汚染菌量、食品由来成分など)によって必ずしも有効とは言えない場合もあり、今後、二次増菌の導入や他の増菌法との併用などを考慮する必要があった。
　イムノキットについては一部の検体で偽陽性が出現する場合があり、迅速で簡便なスクリーニング法としては有効であるが、イムノキットのみでEHEC O157をスクリーニングすることは不適当であると考えられた。

4.　野菜からの凍結損傷EHEC O157分離法の検討
　現在、多くの食品は冷凍状態で流通するケースが多く、食品管理マニュアルでは検食は-20℃で2週間保管することが義務付けられている。したがって、食品中で凍結されることによる損傷を受け、発育し難い状態になっている。また、凍結損傷したEHEC O157分離法について十分な検討がされていない。
　そこで、わが国における集団食中毒事件の主な原因食品である野菜類から効率的な凍結損傷EHEC O157の分離法の検討を行ったところ、ノボビオシンと胆汁酸を除いたmEC培地で25℃2時間培養後、これにノボビオシンと胆汁酸を加えて42℃18時間培養し、さらに、IMS法処理をしてCT-SMACに塗抹する方法が最も良いと考えられた。また、EHEC O157はCHR、BCMなどの酵素基質培地上では特徴のある色彩の集落を形成することから、2種類以上の分離培地を併用することにより分離率が上がると考えられた。

5.　食品、環境水などのEHEC O157の汚染状況調査
　食中毒事件の原因食品として報告のあった食品についてEHEC O157汚染状況を調査した。1996年から2000年の間に、静岡県内で販売されている食肉類333検体、野菜類191検体、その他の食品22検体および環境水など149検体の計695検体についてEHEC O157検査を行ったが、EHEC O157はすべての検体から分離されなかった。
　このことから県内に流通する食品や環境におけるEHEC O157汚染は低率であると考えられた。しかし、食品の汚染菌量が少ない場合には、食品からの菌分離が困難であることは、食中毒事例においてその感染源や原因食品がなかなか解明されないことが示しており、迅速かつ確実に菌分離できる検査方法の確立が望まれた。

　以上の調査・検討の結果、ヒトおよび牛由来EHEC O157のファージ型別に関して新しい知見が得られるとともに、ファージ型別は今回実施した他の疫学マーカーと比べて分離株間の職別が可能であり、わが国ではあまり行われていないが簡便で有用な方法であることが判明した。また、食品(食肉、野菜)からの凍結損傷菌を含むEHEC O157の分離法には、mEC培地など抑制力の弱い培地で前増菌(25℃2時間)を行って菌を回復させた後に、ノボビオシンなどの抑制剤を添加して42℃18時間培養し、免疫磁気分離法で集菌してからセフィキシム亜テルル酸カリウム加ソルビトールマッコンキー培地(CT-SMAC)と酵素基質培地に塗抹する方法が有効な分離法であった。さらに、様々な物理的条件下での増殖性を知り、これを活用することにより食品でのEHEC O157制御の可能性が示唆された。},
 title = {腸管出血性大腸菌 O157 : H7(-) の疫学的解析に関する基礎的研究},
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