⽝のがん関連線維芽細胞における CXCL12/CXCR4軸によるT 細胞動態の調節

工藤, 綾乃

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⽝のがん関連線維芽細胞における CXCL12/CXCR4軸によるT 細胞動態の調節

https://az.repo.nii.ac.jp/records/2000483

名前 / ファイル	ライセンス	アクション
diss_dv_kou189.pdf (81.6 MB)
diss_dv_kou189_jab&rev.pdf (208 KB)

Item type

学位論文 / Thesis or Dissertation(1)

公開日

2025-12-15

タイトル

⽝のがん関連線維芽細胞における CXCL12/CXCR4軸によるT 細胞動態の調節

言語

jpn

資源タイプ

doctoral thesis

アクセス権

open access

アクセス権URI

http://purl.org/coar/access_right/c_abf2

その他（別言語等）のタイトル

その他のタイトル

Exploring the effect of canine cancer-associated fibroblasts on T cell dynamics through the CXCL12/CXCR4 axis modulated by TGF-β1

言語

著者

工藤, 綾乃

抄録

内容記述タイプ

Abstract

内容記述

背景
　獣医療の進歩により犬の平均寿命が大幅に延長したことに伴い、加齢に関連した疾患の発症率が上昇しており、悪性腫瘍は高齢犬における主要な死因となっている。外科手術、化学療法、放射線照射が標準的な治療である一方、転移・浸潤を伴う進行した固形がんに対しては、依然として有効な治療法が乏しい。
　この背景として腫瘍を構築するがん微小環境の存在が影響していると考えられ、なかでもがん関連線維芽細胞 (cancer-associated fibroblasts; CAFs)はその主要な構成要素である。人においては CAFsがケモカインやサイトカインなどの液性因子を介し、抗腫瘍免疫の要であるT細胞の機能を抑制することが報告されている。さらに、CAFsが豊富な腫瘍では T細胞の腫瘍中心部への浸潤が抑制される可能性が提言されており、T細胞動態における CAFsの役割が注目されている。C-X-C motif chemokine ligand 12 (CXCL12) は CAFs が分泌するケモカインの1つであり、T細胞膜上のC-X-C chemokine receptor type 4 (CXCR4) と結合して細胞遊走を誘導する。さらに、このCXCL12/CXCR4軸の調節には、同じく CAFs由来のサイトカインであるtransforming growth factor-beta (TGF-β) が関与することが示唆されている。しかし、犬における CAFsがT細胞に与える影響、特にCXCL12/CXCR4軸を介したT細胞の遊走制御機構については、未だ解明されていない。
　本研究では、犬由来CAFsがCXCL12/CXCR4軸を介してT細胞の遊走動態に及ぼす影響を評価するとともに、TGF-βを介したこの経路の制御機構を解明することで、犬のがん微小環境における免疫抑制機序の一部を明らかにすることを目的とした。

第1章：担がん犬におけるCXCL12/CXCR4発現の解析
　本章では上皮系悪性腫瘍を有する犬におけるCXCL12/CXCR4軸の発現状況を把握するため、以下の解析を実施した。まず免疫組織化学染色を用いてがん間質におけるCXCL12の発現とT細胞の分布を評価し、次いで担がん犬と健常犬の血清CXCL12濃度およびT細胞膜上のCXCR4発現率を比較した。さらに、腫瘍組織および正常皮膚組織からCAFsおよび正常線維芽細胞 (normal fibroblasts; NFs) を分離し、CXCL12分泌量をELISAにより比較した。
　犬の上皮系悪性腫瘍9種70組織の解析により、8種の上皮系悪性腫瘍でCXCL12 陽性が確認された。また、CXCL12陽性症例の一部において、がん間質領域にT細胞の集簇が認められた。上皮系悪性腫瘍に罹患した24症例の末梢血T細胞におけるCXCR4発現率は、健常犬と比較して有意に高かった。18症例からCAFsの分離に成功し、十分な細胞数が得られた10症例のCAFsを本実験に使用した。分離した細胞は間葉系細胞のマーカーであるvimentin陽性かつ上皮系細胞のマーカーであるcytokeratin陰性だった。CAFsは NFsと比較してα-SMAおよびCXCL12の発現が強い傾向が認められた。さらに、CAFs培養上清 (CAFs-CM) 中のCXCL12 濃度はNFsよりも有意に高値を示した。
　以上の結果より、犬においてもがん間質にCXCL12が発現し、犬由来CAFsがCXCL12を分泌すること、さらに担がん犬においてCXCR4陽性T細胞が存在することが明らかになった。

第2章：CAFs由来CXCL12が T細胞遊走に与える影響の評価
　本章では、CXCR4アンタゴニストであるAMD3100を用いて、犬由来CAFsがCXCL12/CXCR4 軸を介してT細胞の遊走を促進するかをBoyden chamber assay で検討した。加えて、腫瘍細胞株との三者共培養系を用いて、CAFsががん細胞の存在下でT細胞動態に与える影響を評価した。
　その結果、CAFs-CMによりCD8+ T細胞の遊走が有意に増加し、AMD3100処理によりその遊走は抑制された。三者共培養系においては犬乳腺癌細胞株との共培養下で、CAFs上に接着するT細胞の密度がAMD3100によって有意に減少した。
　これらの結果から、犬由来CAFsがCXCL12/CXCR4軸を介してT細胞の遊走動態に寄与する可能性が示唆された。

第3章：CAFs由来TGF-βが CXCL12/CXCR4軸に与える影響の評価
　TGF-βは線維芽細胞を含むさまざまな細胞から分泌され、腫瘍進行や免疫抑制に関与するサイトカインである。人における研究ではCAFsはTGF-βを分泌し、それによって自己や周囲の線維芽細胞にCXCL12分泌を促進させる可能性が示されている。また、TGF-βはT細胞上のCXCR4発現を高めることが報告されている。
　そこで本章では、犬由来CAFsがTGF-βを介してCXCL12/CXCR4軸に与える影響を評価するために以下の検討を行なった。まず、TGF-β分泌量をELISAで測定し、TGF-β阻害剤であるSB431542を用いた際のCXCL12分泌およびCXCR4発現への影響を評価した。
　その結果、CAFs-CM中のTGF-β濃度はNFsよりも有意に高く、SB431542の添加によりCAFsのCXCL12分泌は有意に減少することが明らかとなった。さらに、TGF-βやCAFs-CMで培養したT細胞ではCXCR4発現率は有意に増加し、SB431542によりこの増加が抑制され　た。
　これらの結果から、犬CAFsはTGF-βを介して、がん微小環境におけるCXCL12/CXCR4軸を制御している可能性が示唆された。

第4章：CAFs由来TGF-βがNFsに与える影響の評価
　人の創傷治癒において、TGF-βは線維芽細胞の活性化に寄与することが知られている。近年、CAFsが TGF-βを介して周囲の正常線維芽細胞を刺激しCAFs様の活性化細胞への変化を誘導することにより、T細胞の機能抑制に関与する可能性が示唆されている。
　そこで犬においても同様の現象が認められるかを調べるため、本章ではTGF-βやCAFs-CMが犬由来のNFsに与える影響、特に形態変化及びCXCL12分泌への影響を評価した。
　TGF-β処理によりNFsはCAFsに類似した細長い細胞形態へと変化し、CXCL12分泌量は有意に上昇した。一方、CAFs-CMで培養したNFsでは、免疫細胞化学染色にてCXCL12陽性細胞は確認されたものの、分泌量の有意な増加は認められなかった。一貫した結果が得られなかった要因として、
　NFsの個体差が影響した可能性や、CAFs-CM中にはTGF-βに加えて多様な液性因子が含まれておりTGF-β単独の影響を明確に評価することが困難であった可能性が考えられた。

総括
　本研究により、犬由来のCAFsはTGF-βを介してCXCL12/CXCR4軸を制御し、T細胞の動態に影響を及ぼす可能性があることが示唆された。人医療においては、この軸を標的とした治療戦略によりT細胞の腫瘍浸潤を促進し、がん免疫応答を高める試みが進められており、本研究の知見をもとに獣医領域への応用も期待される。本成果は犬のがん微小環境における免疫抑制機構の理解を深めるとともに、がん免疫療法を含む新規治療戦略の構築の一助となることが期待される。

言語

Abstract

内容記述タイプ

Abstract

内容記述

Cancer-associated fibroblasts (CAFs), a heterogeneous population of stromal cells originating from various sources such as resident fibroblasts, stellate cells, mesenchymal stem cells, and endothelial cells, play a crucial role in remodeling the tumor microenvironment (TME). Recent studies have indicated that CAFs may suppress T cell-mediated anti-tumor immunity by forming a dense extracellular matrix and secreting immunomodulatory factors such as CXCL12 and TGF-β. These factors can physically restrict T cell infiltration into tumor tissues and alter T cell migration dynamics, thereby creating an immune-excluded TME.
　Although canine CAFs have been reported to share functional similarities with human CAFs, limited information is available on their immunomodulatory roles in veterinary medicine, especially their effects on T cells.
　This study aimed to elucidate the effects of canine CAFs on T cell migration via the CXCL12/CXCR4 axis and to investigate the regulatory role of TGF-β1 in this context.
　In Chapter 1, CXCL12 expression was observed in the tumor stroma of various canine epithelial tumors, and some cases exhibited a higher number of stromal T cells compared to intratumoral T cells. Additionally, serum CXCL12 levels and the proportion of CXCR4-positive peripheral blood T cells were significantly elevated in tumor-bearing dogs. CAFs isolated from tumor tissues secreted more CXCL12 compared to normal fibroblasts (NFs) from healthy skin.
　Chapter 2 demonstrated that CXCL12 secreted by CAFs facilitated the migration of CXCR4-positive canine T cells toward CAFs in vitro. This chemotactic effect was observed even in the presence of tumor cells, suggesting that CAFs play a dominant role in gathering 　T cells via the CXCL12/CXCR4 axis.
　In Chapter 3, canine CAFs were found to secrete higher levels of TGF-β1 compared to NFs, and this TGF-β1 secretion was positively correlated with CXCL12 production. The inhibition of TGF-β1 signaling led to a reduction in CXCL12 secretion, suggesting that TGF-β1 regulates CAF activation and their production of CXCL12.
　Chapter 4 investigated the ability of TGF-β1 to induce a CAF-like phenotype in NFs. Stimulation with recombinant human TGF-β1 enhanced CXCL12 secretion in NFs, mimicking CAF-like behavior. Conditioned media from CAFs showed partial effects, though results varied, suggesting that further refinement of experimental models—such as co-culture of CAFs and NFs or spheroid systems—may be required to clarify these mechanisms.
　Overall, these findings suggest that canine CAFs modulate T cell migration through the CXCL12/CXCR4 axis under the regulation of TGF-β1 signaling. Given that blockade of the CXCL12/CXCR4 axis has been shown to enhance T cell infiltration in tumors, these results highlight the potential of targeting CAF-mediated immune suppression to improve cancer immunotherapy. A deeper understanding of this regulatory axis may contribute to the development of novel therapeutic strategies in veterinary and comparative oncology.

言語

学位名

博士（獣医学）

学位授与機関

学位授与機関識別子Scheme

kakenhi

学位授与機関識別子

32701

学位授与機関名

麻布大学

学位授与年月日

2025-09-15

学位授与番号

甲第189号

Rights

値

本論⽂の⼀部は以下に公表した。
1. KUDO A., YOSHIMOTO S., YOSHIDA H., IZUMI Y., TAKAGI S., Biological features of canine cancer-associated fibroblasts and their influence on cancer cell invasion, Journal of Veterinary Medical Science, June 2022; 84(6):784-791. The Japanese Society of Veterinary Science
https://doi.org/10.1292/jvms.22-0041
2. KUDO A., SAWAHATA H., YOSHIMOTO S., YAMAUCHI A., OSHIYA R.,
KANAI E., TAKAGI S., Evaluation of the influence of the C-X-C motif chemokine ligand 12 / C-X-C chemokine receptor 4 axis on canine mammary gland tumor cell migration, Journal of Veterinary Medical Science, August 2023; 85(8):837-843. The Japanese Society of Veterinary Science
https://doi.org/10.1292/jvms.23-0126
3. KUDO A., KAMO S., YAMAUCHI A., YOSHIMOTO S., HARADA Y., KANAI E., TAKAGI S., Exploring the effect of canine cancer-associated fibroblasts on T cell dynamics through the CXCL12/CXCR4 axis modulated by TGF-β1, August 2025; 15(1): 31050. Scientific Reports
https://www.nature.com/articles/s41598-025-16312-x

著者版フラグ

出版タイプ

VoR

出版タイプResource

http://purl.org/coar/version/c_970fb48d4fbd8a85

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