高病原性鳥インフルエンザウイルス感染に対するニワトリとマガモの感受性の解明

佐久間, 咲希

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高病原性鳥インフルエンザウイルス感染に対するニワトリとマガモの感受性の解明

https://az.repo.nii.ac.jp/records/2000433

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Item type

学位論文 / Thesis or Dissertation(1)

公開日

2025-07-23

タイトル

高病原性鳥インフルエンザウイルス感染に対するニワトリとマガモの感受性の解明

言語

タイトル

Studies on the susceptibility of chickens and mallards to infection with high pathogenicity avian influenza viruses

言語

jpn

資源タイプ

doctoral thesis

アクセス権

open access

アクセス権URI

http://purl.org/coar/access_right/c_abf2

著者

佐久間, 咲希

抄録

内容記述タイプ

Abstract

内容記述

近年、世界中の家きんや野鳥において高病原性鳥インフルエンザウイルス（HPAIV）が大流行しており、我が国では2020/21 シーズン（2020 年秋から2021年春まで）から2024/25シーズンまで5シーズン連続して家きん飼養施設で高病原性鳥インフルエンザ（HPAI）が発生している。家きん飼養施設でHPAIが発生した場合、家畜伝染病予防法に従った迅速な防疫対応により施設内の家きんは速やかに淘汰される。HPAIの発生が家きん産業に及ぼす被害は甚大であり、我が国では家きんの中でも飼養羽数が多いニワトリにおいて特に被害が大きい。そこで本論文の第1章では、近年に国内で分離されたHPAIVの感染に対するニワトリの感受性を感染試験により解析し、家きんにおけるHPAI 発生状況に強く影響するウイルスの特性の解明を試みた。また、HPAIV は渡り鳥により国内外に拡散されると考えられている。そこで第2章と第 3 章では日本の代表的な冬鳥であるマガモにおいて近年の国内分離株の感染に対する感受性を感染試験により解析し、マガモが近年の国内分離株のキャリアとなり得るかを評価した。全ての動物実験は農研機構病原性動物実験専門委員会の承認を得て（第1章の承認番号：第20-066号、20-078号、第20-084号、第21-001号、第21-026 号、第2章と第3章の承認番号：第R4-I002-NIAH号、第R4-I002-NIAH-2号、第R4-I002-NIAH-3号）、動物衛生研究部門のBSL3施設内で実施した。

第1章：2020/21シーズンに国内で分離された高病原性鳥インフルエンザウイルスのニワトリにおける感染性と致死性、伝播性の解析
2020/21 シーズン、国内の家きん飼養施設ではH5N8亜型のHPAIVによる52件のHPAIが発生した。起因ウイルスは全8分節の遺伝子系統解析によりE1、E2、E3、E5、E7の5つの遺伝子型に分類され、家きんにおけるHPAI発生件数や地域は遺伝子型により異なっていた。本章では、各遺伝子型に属する計5株のHPAIVのニワトリに対する感染性と致死性、ニワトリ群内における伝播性を解析した。そして、これら特性の株間の違いと実際のHPAI発生状況を照らし合わせ、どの特性が発生状況に特に影響するかを考察した。まず、4週齢のニワトリに各遺伝子型のウイルスを102～106 50%発育鶏卵感染量（50% egg infectious dose; EID50）で経鼻接種し、感染成立に必要なウイルス量と感染ニワトリの経過を解析した。その結果、E2 と E3 遺伝子型のHPAIVの50%ニワトリ感染量（50% chicken infectious dose; CID50）は特に低く、それぞれ103.50 EID50と102.75 EID50であり、5株間の差は最大で101.88倍であった。高用量である106 EID50でウイルスを接種したニワトリの平均死亡時間においてもE2とE3遺伝子型のHPAIVの値は特に短く、それぞれ接種3.17日後と3.20日後であり、5株間の差は最大で2.43日であった。これらの結果から、E2とE3遺伝子型のHPAIVの感染性と致死性は他の遺伝子型のウイルスに比べ高いことが示された。次に、106 EID50でウイルスを接種したニワトリ1羽とウイルスを接種していないニワトリ6羽を同居させ、非接種ニワトリの感染率、すなわちウイルスの伝播率を解析した。E2、E3、E5遺伝子型のウイルスの伝播率は80%以上であった一方で、E1 とE7遺伝子型のウイルスの伝播率は20%以下であった。実際のHPAI発生状況と照らし合わせると、本章においてニワトリに高い感染性を示したE2とE3遺伝子型のHPAIVは多数の発生を広い地域（東から南日本）で起こした。一方、ニワトリに高い伝播性を示したE5遺伝子型も含め、低い感染性を示したE1、E5、E7遺伝子型のHPAIVに起因する発生は件数や地域が限定的であった。これらの結果から、本章で解析したウイルスの3つの特性の中で、ニワトリに対する感染性が同シーズンの家きんにおけるHPAI発生状況に強く影響したと考えられた。

第2章：2021/22シーズンに国内で分離された高病原性鳥インフルエンザウイルスのマガモにおける感染性と致死性の解析
HPAIV に感染したカモ類は症状を示さないことが多く、マガモなどの渡り性のカモ類は感染後もウイルスを排出しながら移動することで様々な地域にHPAIVを拡散する。2021/22 シーズン、国内の家きん飼養施設では H5N1 亜型と H5N8 亜型のHPAIVによる25件のHPAIが発生し、起因ウイルスはHA遺伝子の系統解析によってG2a、G2b、G2d の3つのHAグループに分類された（第1章のE2遺伝子型はG2aグループである）。本章の目的は、HPAIVに初めて暴露されたマガモ、すなわちHPAIV に対する免疫を持たないマガモは近年の国内分離株を広域に拡散するキャリアとなり得るかを明らかにすることである。12 週齢のマガモに各 HA グループのHPAIVを102～106 EID50で経鼻接種し、感染性と致死性を解析した。試験に使用したマガモは農場より受精卵で購入し、人工的に孵化・飼育後、A型インフルエンザウイルスに対する血清抗体がないことを試験前に確認している。3株の50%マガモ感染量（50% mallard infectious dose; MID50）は 102.50～103.75 EID50であり、これは以前に報告された同株のCID50より低く、これら3株のマガモに対する感染性はニワトリに対する感染性より高いことが示された。G2aとG2bグループのHPAIVに感染したマガモは全羽生残し、ほとんどの感染マガモは無症状で経過した。一方、G2dグループのHPAIVに感染したマガモの経過は様々であり、低用量で感染したマガモの一部は無症状で経過し、高用量で感染したマガモの一部は死亡した。106 EID50のウイルスを接種したマガモの気管からはMID50と CID50の値を上回る量のウイルスが排出された。これらの結果から、HPAIV に対する免疫を持たないマガモは同シーズンの国内分離株に容易に感染し、感染後にウイルスを排出しながら移動することで広域にウイルスを拡散することが示唆された。

第3章：2021/22シーズンに国内で分離された高病原性鳥インフルエンザウイルスに対するマガモの長期的な免疫応答の解析
第2章において、2021/22シーズンのHPAIVに感染したマガモの多くは無症状で経過し、生残した。一般的に、HPAIV感染により宿主体内にはHAを主要な標的抗原とした体液性免疫が誘導される。野生のマガモは複数回HPAIVに暴露されると想定されるが、過去の感染により獲得した免疫はウイルスに再暴露された際の再感染の成立、そして再感染成立後の病態に影響する。2021/22シーズン、国内ではシーズン前半にG2bグループのHPAIVが主に流行し、後半にG2dグループのHPAIVが主に流行したことから、G2b グループの HPAIV に感染し生残した野生マガモは G2dグループの HPAIV に再び暴露されたことが想定される。第 3 章の目的はマガモがHPAIVに繰り返し感染することにより、1つのシーズン中に何度もHPAIVのキャリアとなり得るかを明らかにすることである。第2章と同じ3株を人工的に孵化・飼育したマガモに低用量（10 MID50; 103.50～104.75 EID50）で接種し、接種後84日間の血清抗体の推移を解析した後、免疫応答の有効性を同じもしくは異なる株を再接種することにより検証した。血清中の接種株に対する中和抗体価は接種28～56日後にピークとなり、3株の最高中和抗体価の中央値は268～806であった。3株の接種84日後の中和抗体価の中央値は106～395であり、接種84日後に同じ株を同じ用量で再接種したところ、全てのマガモにおいて再接種後のウイルス排出は認められず、再接種株に対する抗体価が大きく上昇したマガモも1羽のみであった。また、G2bグループのHPAIVに感染したマガモにG2dグループのHPAIVを再接種した場合においても、ウイルス排出を伴う再感染は認められなかった。これらの結果は、低用量かつ単回のウイルス接種であっても同シーズンのHPAIVはマガモに高いレベルの免疫応答を誘導することを示し、野生下においてマガモがHPAIVに繰り返し感染する頻度は高くなく、1個体が1つのシーズン中にHPAIVのキャリアとなる機会は限られている可能性を提示した。
本論文の結果は、野鳥を対象としたHPAIVのサーベイランス方法の検討に役立てることが出来る。第2章の研究結果では、感染マガモの多くは無症状で経過し、G2aグループのHPAIVに感染したマガモは総排泄腔からのウイルス排出がほぼ認められなかった。死亡野鳥と糞便検体を用いた調査のみでは、野鳥に対して致死性が低い株や感染鳥の糞便中に排出されにくい株の検出は難しい。第3章の研究結果から、少なくとも調査の2～12週間前の感染であれば、血清抗体の検出により感染歴を調べることが可能である。しかし、異なるHAグループに属するHPAIV間で交差反応性を示す場合があるため、感染した株を特定することは困難である。第2章と第3章のどちらにおいても、すべての感染マガモは気管から多くのウイルスを排出した。気管のウイルスは採食などにより湖水などの環境中に排出される。環境水等に含まれるウイルス遺伝子の検出は野鳥におけるHPAIVの流行状況を把握するための有用な手段となると考えられる。

言語

Abstract

内容記述タイプ

Abstract

内容記述

The H5 subtype of high pathogenicity avian influenza (HPAI) viruses (HPAIVs) derived from A/goose/Guangdong/1/1996 have spread globally and circulated in wild and domestic birds for a quarter of a century. In Japan, HPAIV caused outbreaks in poultry for five consecutive seasons, from the 2020/21 season (autumn 2020 to spring 2021) to the 2024/25 season. In the event of an outbreak in poultry, immediate and appropriate initial response measures are taken in accordance with the Act on Domestic Animal Infectious Diseases Control, such as the slaughter of poultry on the premises and disinfection of contaminated areas, to stamp out the disease. Chickens are the most commonly reared poultry species in Japan, and the damage caused by HPAI in chickens is significant. In Chapter 1, I investigated the susceptibility of chickens to infection with HPAIVs recently isolated in Japan and determined the virological characteristics of HPAIVs that strongly influence the prevalence of HPAIVs in poultry. Migratory water birds are considered to be carriers of HPAIVs. Mallards are often observed in Japan during winter, and HPAIV-infected mallards are known to often shed virus asymptomatically. In Chapters 2 and 3, I investigated the susceptibility of mallards to infection with HPAIVs recently isolated in Japan and evaluated whether they are potential carriers of the viruses. All animal experiments were conducted in Biosafety Level 3 facilities at the National Institute of Animal Health, Japan, in compliance with the institutional protocol reviewed and approved by the Institutional Animal Care and Use Committee of the National Agriculture and Food Research Organization. The approval number of the protocols are as follows: Chapter 1, 20-066, 20-078, 20-084, 21-001, 21-026; Chapters 2 and 3, R4-I002-NIAH, R4-I002-NIAH-2, R4-I002-NIAH-3.

Chapter 1: The infectivity, virulence, and transmissibility of HPAIVs isolated in Japan during the 2020/21 season in chickens
During the 2020/21 season, H5N8 HPAIVs caused 52 HPAI outbreaks on poultry premises. These viruses were divided into five distinct genotypes (E1, E2, E3, E5, and E7) based on the constellations of all gene segments, and the prevalence of HPAIVs in poultry differed among genotypes. To investigate the cause of these outbreaks, chickens were experimentally infected with five representative strains of each genotype, and the infectivity, virulence, and transmissibility of HPAIVs in chickens were studied. First, to evaluate the infectivity and virulence, 4-week-old chickens were intranasally inoculated with the viruses at several doses ranging from 102.0 to 106.0 50% egg infectious dose (EID50) and the viral doses required for infection, lethality, and viral shedding were examined. The 50% chicken infectious dose (CID50) differed by up to 101.88 times among the five strains, and the titer was lowest for the E3 strain (102.75 EID50), followed by that of the E2 strain (103.50 EID50). The mean death time of chickens inoculated with each virus at a dose of 106 EID50 differed by up to 2.43 days post-inoculation (dpi), and the titer of the E2 strain (3.20 dpi) was the lowest, followed by that of the E3 strain (3.17 dpi). These results indicated that the infectivity and virulence of the E2 and E3 strains were higher than those of the other strains. To evaluate the transmissibility of the viruses in the chicken population, one chicken was intranasally inoculated with the virus at a dose of 106 EID50 and six naïve chickens were cohabited with the inoculated chicken. The E2, E3, and E5 strains transmitted to naïve chickens with high efficiency (>80%), whereas the other strains showed low transmission efficiency (<20%). Associating these findings with the prevalence of HPAIVs in poultry, the E2 and E3 genotypes, which have higher infectivity, virulence, and transmissibility in chickens than the other three genotypes, have caused a large number of outbreaks on poultry premises over a wide area in Japan. In contrast, poultry outbreaks caused by the three low-infectious genotypes, E1, E5, and E7, were limited in number or area, regardless of other virological characteristics. Among the three virological characteristics of HPAIVs analyzed in this study, the infectivity of HPAIVs in chickens may have strongly influenced the prevalence of HPAIVs in poultry in Japan during this season.

Chapter 2: The infectivity and virulence of HPAIVs isolated in Japan during the 2021/22 season in mallards
HPAIV-infected ducks often shed virus asymptomatically. Migratory waterfowl, such as mallards, which are asymptomatically infected with HPAIVs may act as global carriers of the viruses. During the 2021/22 season, H5N1 and H5N8 HPAIVs caused 25 HPAI outbreaks on poultry premises. Through phylogenetic analysis of the hemagglutinin (HA) genes, these viruses were classified into three groups; G2a, G2b, and G2d (the E2 genotype referred to in Chapter 1 was classified in the G2a group). The study of Chapter 2 aimed to determine whether mallards without immunity to HPAIVs can be asymptomatically infected with viruses of these HA groups and carry them over long distances. Naïve mallards were inoculated with three representative strains of each HA group, and the infectivity and virulence of these strains in mallards were studied. Fertilized mallard eggs were purchased from a mallard farm and the mallards were raised until they were 12 weeks old. Serum samples were collected from all mallards before use in animal experiments to ensure that they were serologically negative for influenza A virus. Mallards were intranasally inoculated with the viruses at several doses ranging from 102.0 to 106.0 EID50. The 50% mallard infectious dose (MID50) for the three strains ranged from 102.50 to 103.75 EID50. The corresponding MID50 values were lower than the CID50 values previously reported, indicating higher infectivity of these strains in mallards than in chickens. All mallards infected with the G2a and G2b strains survived and most showed no clinical signs. Some mallards infected with the G2d strain died, but some mallards were asymptomatic, except when inoculated with a high viral dose (106 EID50). Mallards inoculated with each virus at a dose of 106 EID50 shed enough virus to infect others, exceeding the MID50 and CID50 values. This study showed that HPAIVs recently isolated in Japan were highly infectious to mallards, and that most infected mallards shed virus without clinical signs. These results suggest that mallards without immunity to HPAIVs may be long-distance carriers of the HPAIVs recently isolated in Japan.

Chapter 3: Long-term immune responses induced in mallards by infection with HPAIVs isolated in Japan during the 2021/22 season
In Chapter 2, most mallards infected with HPAIVs isolated in Japan during the 2021/22 season showed no clinical signs and survived. HA is a key antigen-inducing antibody in the humoral immune response to AIVs, and the immune response induced by previous AIV infections has been reported to affect subsequent infections. During the 2021/22 season, the G2b group predominated in the first half of the season and the G2d group predominated in the second half of the season. These facts suggest the possibility that the wild mallards pre-infected with viruses of the G2b group must have been exposed to viruses of the G2d group. The question in Chapter 3 is whether individual wild mallards are repeatedly infected with HPAIVs and act as HPAIV carriers multiple times within a season. Twelve-week-old naïve mallards were inoculated with the three strains used in the experiment of Chapter 2 at low viral doses (10 MID50; dose ranged from 103.50 to 104.75 EID50), and the antibody dynamics in the sera were evaluated for 84 days. To test the efficacy of immunity at 84 dpi following the initial inoculation, the mallards were intranasally challenged with homologous or heterologous strains at low doses (10 MID50). Neutralizing (NT) antibody titers against homologous antigens in the three groups peaked between 28 and 56 dpi. The median maximum NT antibody titer in the three groups ranged from 269 to 806, and the median NT antibody titer at 84 dpi ranged from 106 to 395. In the homologous challenge experiments, all mallards were fully protected from the disease based on viral shedding, and their serum antibody titers were not markedly enhanced by the challenge, except for one mallard. This protection was also observed in the heterologous challenge, in which none of the mallards previously infected with the G2b strain shed virus after challenge with the G2d strain. This study demonstrated that a single low-dose HPAIV infection could induce efficacious immunity against a subsequent infection even after 84 days. These findings suggest that repeated infections with homologous and heterologous HPAIV strains do not occur frequently in individual wild mallards within a season, and that the frequency with which they act as carriers may be limited.

These findings can be used to improve surveillance systems for wild birds which are mainly conducted to find HPAIVs. As described in Chapter 2, all mallards infected with the G2a strain survived and most did not shed viruses from the cloaca. The detection of HPAIVs that are not lethal to wild birds and are not excreted from the cloaca of infected birds may be difficult by testing only samples collected from dead birds and fecal samples of water birds. According to the data on serum antibody dynamics described in Chapter 3, it is possible to investigate the infection history by detecting antibodies in serum samples collected from birds infected with the virus at least two to 12 weeks prior. However, it is difficult to identify the strain that caused the infection because some HPAIV strains belonging to different HA groups show cross-reactivity. In the experiments described in Chapters 2 and 3, all infected mallards shed high titers of viruses from their tracheas. The virus in the trachea is excreted into the environment, such as in lakes, via foraging and other activities. The detection of viral genes in environmental water is thought to be a useful method for understanding the prevalence of HPAIVs in wild birds.

言語

学位名

博士（獣医学）

学位授与機関

学位授与機関識別子Scheme

kakenhi

学位授与機関識別子

32701

学位授与機関名

麻布大学

学位授与年月日

2025-03-07

学位授与番号

乙第450号

Rights

値

本論文の一部は以下に公表した。
＜第1章＞
Sakuma S, Uchida Y, Kajita M, Tanikawa T, Mine J, Tsunekuni R, Saito T (2021) First Outbreak of an H5N8 Highly Pathogenic Avian Influenza Virus on a Chicken Farm in Japan in 2020. Viruses 13(3):489
Sakuma S, Tanikawa T, Tsunekuni R, Mine J, Kumagai A, Miyazawa K, Takadate Y, Uchida Y (2023) Experimental Infection of Chickens with H5N8 High Pathogenicity Avian Influenza Viruses Isolated in Japan in the Winter of 2020-2021. Viruses 15(12):2293
＜第2章、第3章＞
Sakuma S, Mine J, Uchida Y, Kumagai A, Takadate Y, Tsunekuni R, Nishiura H, Miyazawa K (2025) Long-term immune responses induced by low-dose infection with high pathogenicity avian influenza viruses can protect mallards from reinfection with a heterologous strain. Archives of virology 170(2), 33 Reproduced with permission from Springer Nature.

著者版フラグ

出版タイプ

VoR

出版タイプResource

http://purl.org/coar/version/c_970fb48d4fbd8a85

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