ヒト免疫とヒト腸内細菌叢を同時に再構築したデュアルヒト化マウスモデル樹立のための基盤整備に関する研究

何, 裕遥

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ヒト免疫とヒト腸内細菌叢を同時に再構築したデュアルヒト化マウスモデル樹立のための基盤整備に関する研究

https://az.repo.nii.ac.jp/records/2000428

名前 / ファイル	ライセンス	アクション
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diss_de_otsu447_jab&rev.pdf (183 KB)

Item type

学位論文 / Thesis or Dissertation(1)

公開日

2026-01-30

タイトル

ヒト免疫とヒト腸内細菌叢を同時に再構築したデュアルヒト化マウスモデル樹立のための基盤整備に関する研究

言語

jpn

資源タイプ

doctoral thesis

アクセス権

open access

アクセス権URI

http://purl.org/coar/access_right/c_abf2

その他（別言語等）のタイトル

その他のタイトル

Research on the establishment of a foundation for creating a dual-humanized mouse model reconstructing a human microbiome- and immune system

言語

著者

何, 裕遥

抄録

内容記述タイプ

Abstract

内容記述

腸内細菌叢はヒト宿主と共生関係にあり、様々な疾患の病態に関与していることが明らかになっている。特に免疫疾患との関係が注目されており、免疫細胞の分化とその機能に対する腸内細菌叢の生理的な役割について研究が進められている。これらの研究には、無菌マウスにヒト腸内細菌を投与したノトバイオートマウス、あるいはヒト糞便移植に代表されるような、ヒト菌叢を投与したヒト微生物叢関連マウスが用いられている。しかしながらマウスを用いた基礎研究は、種を超えてヒト腸内細菌叢とマウス免疫細胞の相互作用を評価するという点で限界がある。これまでのところ、ヒト腸内細菌叢とヒト免疫を同一生体内で再現するモデル動物は報告されていない。本研究は腸内細菌叢と免疫系の2つをヒト化した「デュアルヒト化マウス」を構築するための研究基盤を整備することを目的とし、以下の研究を実施した。

第1章：ヒト免疫とヒト腸内細菌叢を同時に再構築したデュアルヒト化マウスモデルの樹立
ヒト造血幹細胞を移植したNOGマウスは、免疫系ヒト化マウスとして様々な免疫学研究に活用されている。本研究では無菌NOGマウスにヒト造血幹細胞ならびに糞便を移植し、ヒト免疫とヒト腸内細菌叢を同時に再構築したデュアルヒト化マウスモデルを作製した。まず、無菌NOGマウスにヒト造血幹細胞を移植し、無菌免疫系ヒト化マウスを作成した。その結果、従来のSPF免疫系ヒト化NOGマウスと同様に、末梢血や骨髄、脾臓においてヒトCD45＋白血球の生着が認められた。得られた無菌免疫系ヒト化マウスにヒト糞便を移植することでデュアルヒト化マウスを作製した。次世代シーケンサーを用いて腸内細菌叢構成を分析したところ、移植したヒト糞便ドナーの特徴を反映した菌叢がマウスの腸管に定着していることが確認された。次に、ヒト糞便移植による免疫細胞の構成の変化を分析した。デュアルヒト化マウスと無菌免疫系ヒト化マウスにおける末梢血の免疫細胞の構成を比較したところ、全白血球中のヒト由来CD45+白血球の割合には有意差を認めなかったが、ヒトCD3+T細胞の割合はデュアルヒト化マウスにおいて有意に増加した。また、脾臓におけるデュアルヒト化マウスのCD3+エフェクターメモリーT細胞の割合は無菌免疫系ヒト化マウスよりも高い傾向が認められた。本研究で確立したデュアルヒト化マウスは、ヒト免疫における腸内細菌叢の生理学的役割の解明に寄与するとともに、腫瘍免疫分野における新規前臨床モデルとして有用であると考えられた。

第２章：ビニールアイソレータを用いない無菌マウス飼育方法の開発
マウスを用いたマイクロバイオーム研究を実施する際には、微生物汚染を回避するためにビニールアイソレーター(VI)を用いることが多い。しかしながらVIを用いた実験は、限られたスペースで厚いゴム手袋越しに作業をする必要があるため、時間や労力を要するとともに、実施できる処置に制約がある。本研究では個別換気ケージとバイオバブルを組み合わせることで、実用性の高いヒト微生物叢関連マウスの飼育・実験システムを構築した。本システムは内部の清浄度を高めるバイオバブル内に、陽圧制御の個別換気ケージを設置した2重のバリア機構で構成される。飼育器材はデータロガーの温度データを元に滅菌条件を設定し、高圧蒸気滅菌したものを用いた。まず、本システムをコンベンショナル動物室に導入し、無菌マウスの飼育を試みた。次に、無菌マウスとノトバイオートマウスを同一ラックで飼育し、交差汚染が発生しないか検証した。最後に、陰圧制御飼育室に本システムとバイオセーフティキャビネットを設置し、無菌マウスの飼育を試みた。その結果、いずれの実験環境においても3ヵ月以上にわたって微生物汚染を起こさずに動物を飼育することが可能であった。以上の結果より、本システムが無菌マウスを扱った実験やバイオセーフティレベル2のマイクロバイオーム動物実験に使用できることが示された。本システムは十分な作業スペースを有し、VIでは実施できなかった大型実験機器の搬入が可能に、なる。さらに厚いゴム手袋越しの作業が不要となり、繊細な作業を容易に実施することが可能である。本研究で構築したシステムは、腸内細菌叢の移植実験をはじめとしたマイクロバイオーム研究の作業効率の向上に寄与すると考えられた。

第３章：患者末梢血を移入可能なヒト化マウスの改良
免疫不全マウスにPBMCを移植することで、患者由来のサンプルを用いた免疫系ヒト化マウスを作製することができる。ヒトPBMCの移植には一般にNOGマウスが用いられるが、移植片対宿主病(GVHD)が高率で発症することがしばしば問題となる。これに対しNOG-MHC I/IIの構成遺伝子であるbeta-2 microglobulin (B2m)遺伝子とI-A beta chain遺伝子をダブルノックアウトしたマウス(dKO-tm)は、重篤なGVHDを発症しないことが報告されている。しかしながらdKO-tmは繁殖能が低く、ヒト細胞のキメリズムが低いことが報告されている。本研究では、CRISPR/Cas9を使用して新しいB2m KOマウスモデルを確立した。従来のdKO-tmマウスはB2mおよびI-Ab KOマウスをNOGマウスに戻し交配することで作製したのに対し、改良dKO-emマウスではCRISPR/Cas9ゲノム編集により作製したNOG B2m KOマウスとNOG I-Ab KOマウスを交配し樹立した。NOG、dKO-tm、改良dKO-emの3系統における繁殖成績、GVHDスコア、ヒトPBMCの生着効率を比較した。改良dKO-emマウスでは従来のdKO-tmマウスと比較し、食殺行動の発生率が低く、離乳子数と離乳率がわずかに向上した。PBMC移植後における改良dKO-em のGVHDのスコアはNOGマウスよりも有意に低く、dKO-tmマウスと同等であった。ヒト細胞の生着効率を比較したところ、末梢血のヒトCD45+白血球の割合および脾臓のヒトCD3+T細胞の割合は、改良dKO-emマウスの方がdKO-tmマウスよりも高かった。以上のことから、本研究で樹立した改良dKO-emマウスはヒト化効率の高い有望なマウスモデルになると結論づけられた。改良dKO-emマウスにヒト糞便を移植することで、各患者の免疫状態と腸内細菌叢を反映した疾患モデルを構築できると考えられる。
本研究では腸内細菌叢と免疫系の2つをヒト化したデュアルヒト化マウスの樹立に向けた研究基盤を構築した。本研究で得られた知見を組み合わせることにより、デュアルヒト化マウスを用いた腸内細菌叢の基礎研究を推進させることができると考えられた。

言語

Abstract

内容記述タイプ

Abstract

内容記述

The bacterial microbiota that naturally inhabit human body surfaces, such as the gut, skin, and oral cavity, have long existed in a symbiotic relationship with their human hosts. Recent studies have recognized the involvement of these microbiota in human health and diseases. Notably, their relationship with immune-mediated diseases has attracted attention, and the physiological role of the gut microbiota in the differentiation and functioning of the immune cells has been elucidated. These studies primarily used animal models for experimentation such as gnotobiotic (GB) mice, which are administered gut microbiota isolated from humans, or human microbiota-associated mice, wherein human fecal microbiota is transplanted into germ-free (GF) mice. However, these studies have limitations, as they assessed the interactions between human gut microbiota and mouse immune cells across species.
　This study aimed to establish the basis for developing a "dual-humanized mouse" model. Germ-free NOG mice were used to establish an in vivo experimental model of a dual-humanized mouse, in which both the intestinal flora and immune system are humanized. Furthermore, to promote the adoption of the dual-humanized mouse model, a GF mouse breeding/experimental method without a vinyl isolator (VI) was established, and a genetically modified NOG mouse that was more suitable for the model was created.

Chapter 1: Establishment of a human microbiome- and immune system-reconstituted dual-humanized mouse model.
　Humanized mice created by transplanting human cells or tissues into immunodeficient mice are widely used in biomedical research. Immunodeficient NOG mice injected with human hematopoietic stem cells are useful models for studying the human immune system and for analyzing engrafted human immune cells. The gut microbiota plays a crucial role in the development and function of immune cells and the maintenance of immune homeostasis; however, there is currently no available animal model that has been reconstituted with the human gut microbiota and immune systems in vivo. In this study, I established a new model of CD34+ cell-transferred humanized GF-NOG mice using an aseptic method. Flow cytometric analysis revealed that the GF-humanized mice exhibited lower levels of human CD3+ T cells than the SPF-humanized mice. Additionally, the number of human CD3+ T cells was found to be slightly increased after transplanting the human gut microbiota into GF-humanized mice, suggesting that the human microbiota supports T-cell proliferation and maintenance of the gut microbiota. These observations indicate that dual-humanized mice may be useful for investigating the physiological role of gut microbiota in human immunity in vivo and for application as a new humanized mouse model in cancer immunology.

Chapter 2: Creation of an experimental rearing environment for microbiome animal research using an individually ventilated cage system and bioBUBBLE enclosure.
　The VI is generally used in animal microbiome experiments involving GF or GB mice to avoid the risk of microbial contamination. However, the technique for properly operating VI is difficult; sterility tests essential for monitoring the sterilization of the VI system can take more than 20 days. In this study, an experimental microbiome environment was created in an animal facility by combining an individually ventilated cage (IVC) system and a bioBUBBLE (bB) enclosed cleanroom. A three-step evaluation was conducted. First, the breeding environment was examined to determine the possibility of breeding GF mice without bacterial contamination. Next, it was examined whether GF and GB mice could be housed in the same IVC rack without cross-contamination. Finally, the possibility of breeding GF mice in a negative pressure-controlled biological safety cabinet was explored. In these experiments, it was observed that no microbial contamination occurred for over three months. These results indicate that this IVC-bB combined breeding system is suitable for experiments with GF mice and for Biosafety Level 2 experiments that involve the use of bacteria. This system mitigates the various disadvantages associated with the use of a VI. In conclusion, an experimental setup with improved working time and efficiency suited for microbiome rearing was established, which fared better than previous VIs.

Chapter 3: Improved engraftment of human peripheral blood mononuclear cells in NOG-MHC-double knockout-mice generated using CRISPR/Cas9.
　Human peripheral blood mononuclear cell (PBMC)-engrafted NOG mice are useful models for characterizing human T cells. However, development of graft-versus-host disease (GVHD) limits the use of PBMC engraftments in NOG mice. Previously, an NOG-major histocompatibility complex class I/II double knockout (dKO) mouse model was established. Although humanized dKO mice did not develop severe GVHD, they exhibited impaired reproductive performance and reduced chimerism of human cells. In this study, a novel B2m KO mouse model was established using CRISPR/Cas9. A modified dKO-em mouse model was established by crossing B2m KO with I-Ab KO mice. Reproductivity was slightly improved in the dKO-em mice compared to that in conventional dKO (dKO-tm) mice. The dKO-em mice showed no signs of GVHD after the transfer of human PBMCs and exhibited high engraftment efficiency. The engrafted human PBMCs survived for significantly longer durations in the peripheral blood and spleens of dKO-em mice than in those of the dKO-tm mice. In conclusion, dKO-em mice are a promising PBMC-based humanized mouse model for the development and preclinical testing of novel therapeutics for human diseases.
　The series of studies in this thesis promoted the development of an in vivo experimental model of a dual-humanized mouse, in which both the gut microbiota and the immune system are humanized. These studies contribute to the development of preclinical models for human immune-mediated diseases.

言語

学位名

博士（獣医学）

学位授与機関

学位授与機関識別子Scheme

kakenhi

学位授与機関識別子

32701

学位授与機関名

麻布大学

学位授与年月日

2025-01-27

学位授与番号

乙第447号

Rights

値

本論文の一部は以下に公表した。
1. Yuyo Ka, Ryoji Ito, Ryoko Nozu, Kayo Tomiyama, Masami Ueno, Tomoyuki Ogura and Riichi Takahashi: Establishment of a human microbiome- and immune systemreconstituted dual-humanized mouse model.
Exp Anim, 72(3):402-412, 2023. https://doi.org/10.1538/expanim.23-0025
2. Yuyo Ka, Tomoyuki Ogura, Kayo Tomiyama, Masami Ueno, Ryoko Nozu, Nobuyuki, Tsuruzono, Yuya Nozawa, Mariko Hamano, Akira Takakura and Riichi Takahashi: Creation of an experimental rearing environment for microbiome animal research using an individually ventilated cage system and bioBUBBLE enclosure.
Exp Anim, 70(2):177-184,2021. https://doi.org/10.1538/expanim.20-0129
3. Yuyo Ka, Ikumi Katano, Eiko Nishinaka, Jochen Welcker, Misa Mochizuki, Kenji
Kawai, Motohito Goto, Kayo Tomiyama, Tomoyuki Ogura, Taichi Yamamoto,
Mamoru Ito, Ryoji Ito, and Riichi Takahashi: Improved engraftment of human
peripheral blood mononuclear cells in NOG MHC double knockout mice generated
using CRISPR/Cas9. Immunol Lett, 229:55-61, 2021. doi: 10.1016/j.imlet.2020.11.011.

著者版フラグ

出版タイプ

VoR

出版タイプResource

http://purl.org/coar/version/c_970fb48d4fbd8a85

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