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アイテム
ジクロフェナク誘発急性腎傷害モデルマウスの近位尿細管ミトコンドリアに関する病理学的研究
https://az.repo.nii.ac.jp/records/2000119
https://az.repo.nii.ac.jp/records/2000119727563e9-30a6-41b2-baa2-101d278848bc
| 名前 / ファイル | ライセンス | アクション |
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diss_de_otsu0031.pdf
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diss_de_otsu0031_jab&rev.pdf
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| Item type | 学位論文 / Thesis or Dissertation(1) | |||||||
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| 公開日 | 2024-06-13 | |||||||
| タイトル | ||||||||
| タイトル | ジクロフェナク誘発急性腎傷害モデルマウスの近位尿細管ミトコンドリアに関する病理学的研究 | |||||||
| 言語 | ja | |||||||
| タイトル | ||||||||
| タイトル | Pathological study of proximal tubule mitochondria in diclofenac-induced acute kidney injury model mice | |||||||
| 言語 | en | |||||||
| 言語 | ||||||||
| 言語 | jpn | |||||||
| 資源タイプ | ||||||||
| 資源タイプ | doctoral thesis | |||||||
| アクセス権 | ||||||||
| アクセス権 | open access | |||||||
| アクセス権URI | http://purl.org/coar/access_right/c_abf2 | |||||||
| 著者 |
納谷, 裕子
× 納谷, 裕子
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| 著者(英) | ||||||||
| 姓名 | NAYA, YUKO | |||||||
| 言語 | en | |||||||
| 抄録 | ||||||||
| 内容記述 | ジクロフェナク（DF）はフェニル酢酸系非ステロイド性抗炎症薬（Non-Steroidal Anti-Inflammatory Drugs: NSAIDs）の一つで、解熱鎮痛薬および抗炎症薬として最も頻繁に処方されている。副作用にミトコンドリアを標的とし、活性酸素種を介して腎毒性を誘発することが報告されている。しかし、ミトコンドリアの変化と腎毒性の関連について病理学的手法により詳細に分析した報告は少ない。しかも、腎組織を材料として実験に用いる場合、例えばウェスタンブロッティングによるタンパク発現の解析法では、腎の皮質における尿細管を分類して用いることは非常に厳しい。また、培養細胞によるミトコンドリアの膜電位の変化に関する研究においても尿細管を分類して実験に供することは行われていない。急性腎傷害（acute kidney injury: AKI）において、近位尿細管は好気性代謝に依存しているため、ミトコンドリアの酸化状態によるミトコンドリアの機能不全に関して特に脆弱であると報告されている。本研究の目的は、尿細管の中でも特に近位尿細管とオートファジーの関係性に着目し経時的に組織学的変化の過程を比較検討することである。また、DFの毒性により損傷した近位尿細管のミトコンドリアについて免疫組織化学的ならびに超微形態学的により詳細に解析することである。本研究によりDF誘発によるAKIは近位尿細管損傷後にオートファジーを介して腎皮質全体の損傷に移行する可能性が示唆された。初期段階における近位尿細管の恒常性を維持することでDF誘発性AKIの予防につなげるための裏付けとして、本研究は非常に重要な情報となる。 本研究の概要は以下のとおりである。 AKIマウスモデルの確立および生化学的解析 DF誘発AKIマウスモデル確立のため、6週齢雌ICRマウスを対照群 （n= 3）、DF処置後6、12および24時間群（各 n=3）に分け、対照群には生理食塩水を、DF処置群のマウスにはDFを250 mg/kgの用量で1回腹腔内接種し、処置後各群のマウスから血液および腎臓を採材した（麻布大学動物実験委員会：承認番号170524-2）。血清生化学的分析では、腎機能障害の指標として生化学的血清尿素窒素（BUN）を測定した。結果として時間依存的にBUNが増加し、24時間群において116.3mg/dLと最も高値を示した。 組織学的検査 各群の腎組織におけるヘマトキシリン・エオジン（HE）染色標本の観察を光学顕微鏡にて行った。倍率400倍で無作為に10視野選択し、空胞変性尿細管数を数え、変性の程度に基づいて、軽度、中等度および重度の3段階に分類した。この操作を5回行い、空胞変性尿細管数の半定量的評価を行った。DF処置群における尿細管の空胞変性を特徴とする尿細管損傷について6、12および24時間群の順に変性細胞数の増加が認められ、有意な時間依存性の腎損傷が示された。 免疫組織化学 腎組織においてp62、シトクロム c オキシダーゼ ポリペプチド IV （COX IV） 、8-nitroguanosine、微小管関連タンパク質1（MAP1） 軽鎖 3（LC3） およびリソソーム膜関連プロテイン1（LAMP-1）の免疫組織化学的検出を行った。 また、p62 以外の抗原については連続切片を使用し、同じ尿細管細胞の細胞質における2抗原の陽性反応（COX IV および 8-nitroguanosine、LC3および LAMP-1） の局在を確認した。半定量的評価を行い、Tukeyの多重比較検定によって評価し統計分析を行った。 これらの結果から近位尿細管のミトコンドリア損傷において、DF処置マウスの尿細管の細胞質では COX IV陽性顆粒数の増加が認められ、また、6時間群と比較して12および24時間群の変性した近位尿細管において、陽性顆粒の増加がより顕著であった。さらに、免疫染色スコアは、対照群と比較して、12および24時間群で有意に増加し、COX IVおよび 8-nitroguanosine陽性顆粒は、変性した近位尿細管細胞の細胞質内のほぼ同じ位置での局在が認められた。一方、近位尿細管におけるオートファジーの確認のためのp62の免疫組織化学的解析では、12および24時間群の変性近位尿細管に多数の陽性顆粒の存在が確認され、12時間群で最大値を示した。p62と 同様にLC3においても、24時間群よりも12時間群でより多くの陽性細胞が観察され、LC3陽性顆粒と LAMP-1陽性顆粒の共局在が認められた。 ウェスタンブロッティング 凍結した腎皮質を用い、LC3-I（16 kDa）および LC3-II（14 kDa）についてウェスタンブロット解析を行った。この検出結果をImage JおよびPhotoshopを用いて半定量解析を行った。対照群の発現レベルと比較して、12および24時間群におけるLC3-I発現の有意な増加が認められた。 近位尿細管の電子顕微鏡所見 腎皮質の電子顕微鏡所見において、DF処置群では対照群と比較し、より多くのミトコンドリアの変性、膨化および断片化が認められた。 6時間群では軽度のミトコンドリア変性が観察されたが、12および 24 時間群では重度のミトコンドリア変性が顕著に認められた。 また、12および24時間群ではほとんどの変性ミトコンドリアが断片化していることも確認された。 変性ミトコンドリアを含むオートファゴソームは6時間群では認められず、12時間群で顕著に認められた。さらに24時間群においては、オートファゴソーム像は減少し、分断化して変性したミトコンドリアが多数認められた。 NSAIDsは、アラキドン酸カスケードにおけるシクロオキシゲナーゼの阻害を通じて腎臓の血行動態を変化させ、刷子縁の喪失、尿細管の拡張、進行性病変の形成などの腎損傷を示す腎構造の変化を引き起こすことによりAKIを誘発するとされており、中でもDFはミトコンドリアを標的とし、ROS産生を介して腎毒性を誘発し、酸化ストレスと重大な DNA断片化を引き起こすことが報告されている。近年の報告では、ミトコンドリア膜電位、マイトファジーおよびミトコンドリアの断片化について培養細胞や腎組織の皮質全体を材料として検討されているが、本研究ではDFによる 損傷のターゲットの1つである腎臓の近位尿細管に焦点を当てて病理学的に検討した。DF誘発による酸化ストレスが DNA損傷を引き起こし、損傷した DNAの断片は細胞小器官、核またはミトコンドリアDNAのニトロ化核酸塩基として局在する可能性があり、免疫組織化学的にCOX IV陽性の細胞質顆粒は、損傷したミトコンドリアDNAを示すものと解釈された。COX IVと8-nitroguanosine免疫組織化学分析により、DF処置マウスの変性した近位尿細管細胞におけるこれらの局在がほぼ一致していることが明らかになった。 また、オートファジー関連抗原（p62、LC3、LAMP-1）における免疫組織化学分析によりオートファジー活性はDF処置後12時間で最大を示すことが明らかとなった。加えて電子顕微鏡所見により、DF処理後 12時間で損傷したミトコンドリアを処理するオートファジー（マイトファジー）像が顕著に示され、24時間でマイトファジー像の減少が認められ、代わりに多くの損傷および断片化したミトコンドリアが観察された。この結果は免疫組織化学分析の結果と一致した。 一方、LC3-IおよびⅡのウェスタンブロッティングの結果では、オートファジー活性は24時間で最も高かった。このことについては冒頭でも述べたが、ウェスタンブロッティングのサンプルを採材する際、遠位尿細管や糸球体などの近位尿細管以外の組織が含まれることに起因している。今回、腎皮質の近位尿細管に焦点を絞り、解析したことにより近位尿細管において24時間よりも早い段階での傷害が明らかとなった。DFの毒性が、損傷したミトコンドリアを除去するオートファジー機構であるマイトファジーの活性化とともに、近位尿細管におけるミトコンドリアの損傷および断片化を引き起こすことが確認され、 さらに、近位尿細管におけるマイトファジー活性は、12時間と比較して24時間で低下しており、損傷したミトコンドリアの処理が停滞することで、マイトファジーのクリアランス能力を超えた損傷ミトコンドリアの蓄積により尿細管上皮細胞のさらなる損傷を引き起こすことが示唆された。 近年、ミトコンドリア機能不全に関する研究は、AKIの治療法を特定するための刺激的な新分野として浮上している。中でも、ミトコンドリアの断片化の抑制がアポトーシスの抑制につながること、ミトコンドリア分裂因子であるmitochondrial fission factorの阻害が虚血性腎損傷モデルマウスにおけるミトコンドリアの恒常性を維持すること、また、腎虚血プレコンディショニング（IPC）中にマイトファジーが活性化される場合、Fundc1がミトコンドリア分裂の調節に関与するなどの報告があり、AKIにおけるミトコンドリアの断片化は重要な役割を果たす。今回の超微形態学的所見においても12 および24時間のDF処置群の近位尿細管の細胞質に断片化したミトコンドリアが認められた。 この研究は、DF誘発性腎損傷を保護または改善するために近位尿細管ミトコンドリアを標的とし解析するための報告として非常に重要である。 多くの研究がDFによる処置後24時間で腎障害の発生を報告している。本研究においても血清学的分析およびウェスタンブロッティング解析の結果ではDF処置後24時間まではDF誘発性腎損傷の時間依存性の増悪を示した。これは近位尿細管以外の尿細管を含む腎皮質全体の損傷を反映していると考えられた。一方で今回、病理学的に近位尿細管に焦点を当てた結果、組織学的データの統計解析および電子顕微鏡所見による明確な裏づけにより、オートファジー活性がDF処置後12時間でピークに達することが確認された。同時に、DF処置後24時間では、オートファジー活性の低下および電子顕微鏡所見から多数の除去されていない損傷ミトコンドリアおよび断片化が認められた。p62、LC3およびLAMP-1が12時間で最大値を示したことから、24時間より早い段階の12時間においてオートファジー活性が高いことが明らかとなった。本研究により腎皮質全体の傷害は近位尿細管におけるマイトファジーの停滞すなわち損傷ミトコンドリア蓄積により悪化する可能性があり、今後のAKIの予防への応用として、初期段階で近位尿細管のミトコンドリアの恒常性を維持することでDF誘発性のAKIを軽減できる可能性があることが示唆された。 |
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| Abstract | ||||||||
| 内容記述 | Diclofenac (DF) is one of the phenylacetic acid non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) and is frequently prescribed as an antipyretic analgesic and anti-inflammatory drug. It has been reported that adverse drug reaction include targeting mitochondria and inducing nephrotoxicity via reactive oxygen species. However, there are few reports that have analyzed in detail the relationship between mitochondrial changes and nephrotoxicity using pathological methods. Furthermore, when kidney tissue is used as a material for experiments, for example, when analyzing protein expression by Western blotting, it is extremely difficult to classify and use renal tubules in the kidney cortex. Furthermore, in research on changes in mitochondrial membrane potential using cultured cells, renal tubules have not been classified and subjected to experiments. In acute kidney injury (AKI), the proximal tubule has been reported to be particularly vulnerable to mitochondrial dysfunction due to mitochondrial oxidative status because of its dependence on aerobic metabolism. The purpose of this study was to focus on the relationship between autophagy and the proximal tubule, and to compare and examine the process of histological changes time dependence. In addition, we will conduct a detailed immunohistochemical and ultramorphological analysis of mitochondria in the proximal tubules damaged by DF toxicity. This study suggested that DF-induced AKI may shift to damage to the entire renal cortex via autophagy after proximal tubular damage. This study provides extremely important information to support the prevention of DF-induced AKI by maintaining proximal tubule homeostasis in the early stages. The outline of this research is as follows. Establishment and biochemical analysis of AKI mouse model For establishment a DF-induced AKI mouse model, 6-week-old female ICR mice were divided into a control group (n = 3) and 6, 12, and 24-hour post-DF treatment groups (n = 3 each), and the control group received saline. Mice in the DF treatment group were intraperitoneally inoculated once with DF at a dose of 250 mg/kg, and blood and kidneys were collected from the mice in each group after treatment (Azabu University Animal Care and Use Committee: approval number 170524). -2). In serum biochemical analysis, biochemical serum urea nitrogen (BUN) was measured as an indicator of renal dysfunction. As a result, those BUN increased in a time-dependent manner, with the highest value at 116.3 mg/dL in the 24-hour group. Histological examination Hematoxylin and eosin (HE) stained specimens of kidney tissue from each group were observed using a light microscope. Ten fields of view were randomly selected at 400x magnification, the number of vacuolated tubules was counted, and the degeneration was classified into 3 stages: mild, moderate and severe based on the degree of degeneration. This operation was repeated 5 times, and the number of vacuolated renal tubules was semi-quantitatively evaluated. Concerning renal tubular damage characterized by vacuolar degeneration of renal tubules in the DF treatment group, an increase in the number of degenerated cells was observed in the 6, 12, and 24-hour groups, indicating significant time-dependent renal damage. Immunohistochemistry Immunohistochemical detection of p62, cytochrome c oxidase polypeptide IV (COX IV), 8-nitroguanosine, microtubule-associated protein 1 (MAP1) light chain 3 (LC3), and lysosomal membrane-associated protein 1 (LAMP-1) was performed in renal tissues. For antigens other than p62, serial sections were used to confirm the localization of positive reactions for two antigens (COX IV and 8-nitroguanosine, LC3 and LAMP-1) in the cytoplasm of the same renal tubular cells. A semi-quantitative evaluation was performed using Tukey's multiple comparison test and statistical analysis was performed. These results showed that mitochondrial damage in the proximal tubules was associated with an increase in the number of COX IV-positive granules in the cytoplasm of the tubules of DF-treated mice, and an increase in the number of COX IV-positive granules in the 12- and 24-hour groups compared to the 6-hour group. An increase in many positive granules was observed in the proximal tubule. Furthermore, the immunostaining scores showed a significant increase in the 12- and 24-hour groups compared to the control group, and COX IV and 8-nitroguanosine-positive granules were approved at approximately the same location within the cytoplasm in degenerating proximal tubular cells. Immunohistochemical analysis of p62 in proximal tubular epithelial cells was performed. There were many p62-positive proximal tubules in the 12-hour and 24-hour groups. More positive cells were observed in the 12-hour group than in the 24-hour group. An increase in the number of both LC3– and LAMP-1–positive granules was also observed in the cytoplasm of renal epithelial cells; large numbers of granules were present in degenerated renal tubules in the 12- and 24-h groups. In LC3, as with p62, more positive cells were observed in the 12-hour group than in the 24-hour group. Analysis of serial sections of renal tissues showed co-localization of LC3– and LAMP-1–positive granules. Western blotting Western blot analysis was performed for LC3-I (16 kDa) and LC3-II (14 kDa) using frozen renal cortex. In addition, analysis of blotting images using ImageJ software revealed a significant increase in LC3-I expression in the samples from the 12- and 24-h treatment groups compared with the level of expression in the control samples. Electron microscopic findings of proximal tubules Electron microscopic findings of the renal cortex showed more mitochondrial degeneration, swelling, and fragmentation in the DF-treated group than in the control group. Mild mitochondrial degeneration was observed in the 6-hour group, but severe mitochondrial degeneration was markedly observed in the 12- and 24-hour groups. It was also confirmed that most of the degenerated mitochondria in the 12 and 24-hour groups were fragmented. Autophagosomes containing degenerated mitochondria were not observed in the 6-hour group, but were significantly observed in the 12-hour group. Furthermore, in the 24-hour group, the number of autophagosomes decreased, and many fragmented and degenerated mitochondria were observed. NSAIDs induce AKI by altering renal hemodynamics through inhibition of cyclooxygenase in the arachidonic acid cascade and causing renal structural changes indicative of renal damage, such as brush border loss, tubular dilatation, and progressive lesion formation. DF has been reported to target mitochondria, induce nephrotoxicity through ROS production, and cause oxidative stress and significant DNA fragmentation. In recent reports, mitochondrial membrane potential, mitophagy and mitochondrial fragmentation have been studied using cultured cells and the whole cortex of kidney tissue as material. However, in this study, we focused on proximal tubule, which is one of the targets of damage caused by DF. The pathological examination focused on the renal tubules. DF-induced oxidative stress causes DNA damage, and fragments of damaged DNA can be localized as nitrated nucleobases in organelles, nuclear or mitochondrial DNA, and COX IV-positive cytoplasmic granules was interpreted as indicating damaged mitochondrial DNA in immunohistochemistry. It revealed that COX IV and 8-nitroguanosine have nearly identical localization within the same cell in degenerating proximal tubular cells of DF-treated mice in Immunohistochemical analysis. Furthermore, immunohistochemical analysis of autophagy-related antigens (p62, LC3, LAMP-1) revealed that autophagy activity reached its maximum 12 hours after DF treatment. In addition, electron microscopy findings showed that 12 hours after DF treatment, autophagy (mitophagy) that processes damaged mitochondria was clearly observed, and at 24 hours, the mitophagy pattern decreased, and instead damaged and fragmented mitochondria were observed. This result was consistent with the results of immunohistochemical analysis. On the other hand, Western blotting results for LC3-I and II showed that autophagy activity was highest at 24 hours. As mentioned at the beginning, this is because when collecting Western blotting samples, tissues other than the proximal tubule, such as the distal tubule and glomerulus, are included. In this study, we focused our analysis on the proximal tubule of the renal cortex, and found that injury occurs in the proximal tubule at an earlier stage than 24 hours. It was confirmed that DF toxicity causes mitochondrial damage and fragmentation in the proximal tubule, along with activation of mitophagy, an autophagy mechanism that removes damaged mitochondria. Furthermore, autophagy activity decreased at 24 h compared to 12 h, suggested that it stops processing damaged mitochondria and causes further damage to proximal tubule cells due to accumulation of damaged mitochondria after reduced the clearance capacity of mitophagy. Recently, research on mitochondrial dysfunction has emerged as an exciting new field for identifying treatments for AKI. Inhibition of mitochondrial fragmentation leads to inhibition of apoptosis, inhibition of mitochondrial fission factor maintains mitochondrial homeostasis in ischemic kidney injury model mice, and renal ischemic preconditioning. It has been reported that Fundc1 is involved in regulating mitochondrial fission when mitophagy is activated during IPC, and mitochondrial fragmentation plays an important role in AKI. Ultramorphological findings also showed fragmented mitochondria in the cytoplasm of the proximal tubules of the DF treatment group at 12 and 24 hours. This study is very important as a report for targeting and analyzing proximal tubular mitochondria to protect or ameliorate DF-induced renal damage. Many studies have reported the occurrence of renal damage 24 hours after treatment with DF. In this study, the results of serological analysis and Western blotting analysis showed a time-dependent exacerbation of DF-induced renal damage up to 24 hours after DF treatment. This was thought to reflect damage to the entire renal cortex, including tubules other than the proximal tubule. On the other hand, because of focusing pathologically on the proximal tubule, we confirmed that autophagic activity reaches its peak 12 hours after DF treatment, with clear evidence from statistical analysis of histological data and, electron microscopic findings. At the same time, after 24 h of DF treatment, autophagy activity decreased, and electron microscopy showed many damaged mitochondria and fragmentation. As p62, LC3, and LAMP-1 showed maximum values at 12 hours, it became clear that autophagy activity was high at 12 hours, earlier than at 24 hours. This study shows that damage to the entire renal cortex may be exacerbated by stagnation of mitophagy or accumulation of damaged mitochondria in the proximal tubule. As a future application for AKI prevention, it was suggested that DF-induced AKI may be alleviated by maintaining mitochondrial homeostasis in the proximal tubule at an early stage. |
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| 学位名 | ||||||||
| 学位名 | 博士(学術) | |||||||
| 学位授与機関 | ||||||||
| 学位授与機関識別子Scheme | kakenhi | |||||||
| 学位授与機関識別子 | 32701 | |||||||
| 学位授与機関名 | 麻布大学 | |||||||
| 学位授与年月日 | ||||||||
| 学位授与年月日 | 2024-03-05 | |||||||
| 学位授与番号 | ||||||||
| 学位授与番号 | 乙第31号 | |||||||
| Rights | ||||||||
| 値 | 本研究の成果は以下の学術雑誌に掲載されたものである。 Naya,Y.,Hata,N.,Kobayashi,M.,Thuyuki,M.,Koyama,Y.,Ogihara,K.:P athological study of proximal tubule mitochondria in diclofenac induced acute kidney injury model mice. Tissue and Cell,Oct:84:102188. (2023) DOI: 10.1016/j.tice.2023.102188 |
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| 著者版フラグ | ||||||||
| 出版タイプ | VoR | |||||||
| 出版タイプResource | http://purl.org/coar/version/c_970fb48d4fbd8a85 | |||||||
| 開始ページ | 1 | |||||||
