2026-03-09T14:41:18Z https://az.repo.nii.ac.jp/oai

oai:az.repo.nii.ac.jp:02000469 2025-12-08T01:39:52Z 17:40:1759298680015 370:197:376

Investigation of a Membrane Filter Protocol for Direct Identification of Microorganisms in Dog Ear Discharge using MALDI-TOF MS MALDI-TOF MS を用いたイヌ耳漏中の微生物における直接同定のためのメンブレンフィルター法の開発研究 前田, 浩人 open access Otitis externa is an ear disease that is present in 10-20% of dogs. Bacterial organisms are a common cause, and infection may cause severe and chronic inflammation. Thus, there is a need for early detection and identification of bacteria in ear discharge samples. In this study, 31 such samples were analyzed to identify microorganisms using MALDI-TOF MS with pretreatment using a membrane filtration protocol and a rapid BACpro II kit, compared to pretreatment with a rapid BACpro II kit alone. Reliable scores for E. coli and E. faecalis were obtained after inoculation of samples with 1.0×104 CFU/ml using the membrane filter with the rapid BACpro II kit, with approximately 10-fold higher sensitivity compared to rapid BACpro pretreatment alone. Among 31 bacteria-positive colonies in the samples, MALDI-TOF MS and membrane filtration (0.80 µm) with a rapid BACpro II kit was significantly more accurate compared to use of the kit alone (29 (82.9%) vs. 17 (48.6%) isolates identified, p<0.001). These results show that MALDI-TOF MS with a membrane filter and a rapid BACpro II kit is a quick and reliable method for bacterial identification in ear discharge samples. 【背景・目的】 質量分析技術の進歩は目覚ましく、その臨床応用も加速している。質量分析技術の臨床検査における臨床応用は 1）網羅的プロテオーム・メタボローム解析による新たなdiagnostic biomarkerの探索および 2）細菌検査における質量分析技術の活用に大別される。 網羅的プロテオーム解析では、ネコ慢性腎臓病の新規診断マーカーの探索を行っている。ネコの腎疾患は臨床現場において増加傾向にあり、腎機能異常を早期の段階で評価できる検査方法により的確に診断し、病態を把握することが重要である。臨床現場において慢性腎臓病の病期分類は、国際腎臓病研究グループの基準に従って血漿クレアチニンと対称性ジメチルアルギニン（SDMA）を基に分類しているのが現状である。血漿クレアチニンは性差、年齢、筋肉量など腎臓以外の因子が検査データに影響を与え、軽度腎機能低下では異常値を示さない、いわゆるblind areaの存在が知られ、SDMAは糸球体濾過量が約40％以上失われてから数値が上昇することが知られている。網羅的プロテオーム・メタボローム解析技術を用いて、新たなネコ慢性腎臓病の新規診断マーカーとして、apolipoprotein A-IV、Carboxylesterase 5A、kidney injury molecule-1、vitamin K-dependent protein Cを見出した。 微生物検査では、新しい同定法としてマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析計（MALDI-TOF MS）が有用であることがわかり、日本でもMALDI-TOF MSの導入が急激に進んでいる。これは微生物検査の大きな技術革新として検査のワークフローを一変させた技術であり、従来法の課題であった迅速性、正確性、低ランニングコストを実現したと言われている。MALDIバイオタイパーは、2009年に欧州でIVD-CE マーク（欧州CEマーク認証　体外診断用医療機器）を取得したことで医療機器としての使用が世界的に広まり、現在、世界で6000 システム以上、日本国内でも450システム以上が稼働している。質量分析技術を用いた微生物同定の前処理法は、血液培養ボトルからの微生物を直接同定するために必要とされ、MALDI Sepsityper® kit、VITEK® MS血液培養キット、rapid BACpro® II kitの3キットが販売されている。どのキットにおいても最低検出感度は、1.0×105 CFU/ml である。 本研究においてメンブレンフィルター法とrapid BACpro® II kitを組み合わせることで感度を10倍以上向上することを目的とし、イヌ耳漏中の微生物同定により構築した前処理法を評価した。 【対象・方法】 1）標準菌株、イヌ耳漏検体、培養方法、菌量測定 使用する標準菌株はATCC®（American Type Culture Collection）から購入したEscherichia coli（E. coli ) (ATCC 4157)とEnterococcus faecalis (E. faecalis ) (ATCC 7080)とした。 2023年10月11日から2024年2月29日の間に前田獣医科医院に受診したイヌ31匹（雄：18匹、雌：13匹、0－10歳）を対象とした。 標準菌株のペレット及びイヌ耳漏検体を溶解し、トリプチケースソイ5％ヒツジ血液寒天培地（日本BD社）に塗布し、35℃で18－24時間培養した。 菌量測定はbioMérieux TEMPO® system（ビオメリュー・ジャパン社）を用いた。 2）メンブレンフィルターによる前処理 耳漏検体は滅菌綿棒を用いて採取した。耳漏検体を滅菌水1mLに接種し、500×gで30秒間遠心分離した。上清を、0.30µmまたは0.80µmのMF-Milliporeメンブレンフィルター（Merck KGaA、ダルムシュタット、ドイツ）を装着した1mLシリンジに手動で吸引し、0.30µmまたは0.80µmのMF-Milliporeメンブレンフィルターを装着した1mLシリンジを用いて、rapid BACpro II kit reaction buffer 15mLで洗浄した。 3）rapid BACpro® II kit 血液陽性ボトルから直接MALDI-TOF MSで同定する前処理キットであるrapid BACpro® II kit（日東紡メディカル株式会社）を用いてメンブレンフィルターにより処理した耳漏検体の直接同定を行った。メンブレンフィルター処理した溶液（5mL）または滅菌水に耳漏検体を接種した溶液（1mL）を15000×gで10分間遠心し、上清を捨て、reaction buffer 1 10µL、reaction buffer 2 100µL、およびポリマー懸濁液10µLを混合した。混合溶液は2000×gで30秒間遠心し、上清を捨て、70%アセトニトリル1mLを混合し、2000×gで30秒間遠心した。上清を捨て、70%ギ酸30µLと100%アセトニトリル100µLを混合し、2000×gで60秒間遠心し、上清を細菌同定サンプルとした。 4）微生物同定方法 ①日常検査法 日常検査法は、グラム陽性菌はPos IDパネルを、グラム陰性菌はNeg IDパネル（ベックマン・コールター社）を使用した。また、測定にはMicroScan WalkAway plus system（ベックマン・コールター社）を使用し同定し、同定結果が疑われる菌株については，生化学的性状試験などの追加試験を行い最終同定菌名とした。 ②16S rRNA 遣伝子のシークエンス解析 トリプチケースソイ5%ヒツジ血液寒天培地で培養したコロニーから集菌し、MagNAPure Compact DNA isolation kit 1 (Roche Molecular Biochemicals)を用いてDNA抽出を行なった。16S rRNA遺伝子のPCR増幅用プライマーには， 8UA (5’－AGAGTTTGATC　(A/C)　TGGCTCAG－3’、不変領域) と1485B (5’ －TACGGTTACCTTGTTACGAC－3’、不変領域) を用いることによりほぼ全長1500bpのPCR産物を得た。PCRには1x GoTaq Master mix（Promega）、終濃度0.5 µMのプライマー（8UAおよび1458B）を使用し、温度条件は初期変性95℃、5分間、続いて変性95℃、30秒間、アニーリング55℃、30秒間、伸長72℃、90秒間を30サイクル、最後の伸長を72℃、5分間で行った。シーケンス用プライマーには，519A（5’一CAGC (A/C) GCCGCGGTAAT－3’、不変領域）、　519B (5’一ATTACCGCGGC (G/T)GCTG－3’、不変領域)、　907A (5’一AAACT (T/C)　AAA (T/G) GAATTGACGG－3’、不変領域)、　907B (5’一CCGTCAATTC (A/G) TTT (A/G) AGTTT－3’、不変領域)を用い、Applied Biosystems 3130/Genetic Analyzer (Applied Biosystems)で塩基配列を決定した。塩基配列の既存菌種との相同性検索は、GenBank/EMBL/DDBJデータベースを利用した。 ③質量分析計法 MTP BigAnchorChipターゲットプレート上に薄く均一になるように塗布し、乾燥後1μLのα‐シアノ‐4‐ヒドロキシケイ皮酸マトリックス溶液を添加し乾燥後、MALDI Biotyper（ブルカージャパン社）で測定した。得られたマススペクトルを菌種ごとにマススペクトルをデータベース化したMALDI BioTyperTM 4.1（ブルカージャパン社）で照合し、Score valueが2.000以上を種レベルの同定とした。Score value において、種レベルの同定は2.000－3.000、属レベルの同定は1.700－1.999、同定不可は0.000－1.699と数値で表示される。 【結果】 1）メンブレンフィルター法とrapid BACpro® II kitを組み合わせることによる細菌同定の向上 細菌同定の感度向上を目的に前処理としてメンブレンフィルター法、rapid BACpro® II kit、メンブレンフィルター法とrapid BACpro® II kitを組み合わせる方法を検討した。MALDI Biotyperの種レベルの同定はscore value 2.000－3.000である。0.30µm MF-Milliporeメンブレンフィルターの前処理は、E. coliでは、1.0×104 CFU/mLでscore value 1.984、1.0×105 CFU/mLでscore value 2.413であり、E. faecalisでは、1.0×104 CFU/mLでscore value 1.815、1.0×105 CFU/mLでscore value 2.117であった。0.80µm MF-Milliporeメンブレンフィルターは、E. coliでは、1.0×104 CFU/mLでscore value 1.982、1.0×105 CFU/mLでscore value 2.332であり、E. faecalisでは、1.0×104 CFU/mLでscore value 1.803、1.0×105 CFU/mLでscore value 2.041であった。rapid BACpro® II kitは、E. coliでは、1.0×104 CFU/mLでscore value 1.974、1.0×105 CFU/mLでscore value 2.392であり、E. faecalisでは、1.0×104 CFU/mLでscore value 1.822、1.0×105 CFU/mLでscore value 2.105であった。0.30µm MF-Milliporeメンブレンフィルターとrapid BACpro® II kitを組み合わせた前処理は、E. coliでは、1.0×103 CFU/mLでscore value 1.824、1.0×104 CFU/mLでscore value 2.126、1.0×105 CFU/mLでscore value 2.406であり、E. faecalisでは、1.0×103 CFU/mLでscore value 1.805、1.0×104 CFU/mLでscore value 2.014、1.0×105 CFU/mLでscore value 2.204であった。0.80µm MF-Milliporeメンブレンフィルターとrapid BACpro® II kitを組み合わせた前処理は、E. coliでは、1.0×103 CFU/mLでscore value 1.912、1.0×104 CFU/mLでscore value 2.110、1.0×105 CFU/mLでscore value 2.336であり、E. faecalisでは、1.0×103 CFU/mLでscore value 1.934、1.0×104 CFU/mLでscore value 2.128、1.0×105 CFU/mLでscore value 2.244であった。メンブレンフィルター法及びrapid BACpro® II kitは、細菌同定のために1.0×105 CFU/mL以上の菌量が必要であるが、メンブレンフィルター法とrapid BACpro® II kitを組み合わせることで、1.0×104 CFU/mL以上の菌量となる。 2）MALDI Biotyperによる耳漏検体の細菌同定 耳漏検体を滅菌水で溶解し、トリプチケースソイ5％ヒツジ血液寒天培地に塗布し、35℃で18時間培養した。耳漏検体31検体中30検体でコロニーが認められ、25検体は1菌種、5検体は2菌種同定された。1検体はコロニーが認められなかった。 1菌種含まれている耳漏検体の直接同定において、rapid BACpro® II kitの前処理は15検体で同定され、0.30µmおよび0.80µm MF-Milliporeメンブレンフィルターとrapid BACpro® II kitを組み合わせた前処理は、それぞれ19検体および21検体を同定し、有意な違いがみられた（p<0.01）。rapid BACpro® II kitで同定されなかった10検体は、1.0×105 CFU/mL以下の菌量であり、検出限界以下であった。0.30µmおよび0.80µm MF-Milliporeメンブレンフィルターとrapid BACpro® II kitを組み合わせた前処理で同定されなかった検体は、1.0×104 CFU/mL以下の菌量であり、検出限界以下であった。0.80µm MF-Milliporeメンブレンフィルターとrapid BACpro® II kitを組み合わせた前処理で同定された2検体は、1.0×104 CFU/mL以下の菌量であったが同定され、Corynebacterium diphtheriaeとMalassezia pachydermatisであった。2菌種含まれている耳漏検体の直接同定において、rapid BACpro® II kitの前処理は同定されず、0.30µmおよび0.80µm MF-Milliporeメンブレンフィルターとrapid BACpro® II kitを組み合わせた前処理は、それぞれ1検体および3検体を同定し、有意な違いがみられた（p<0.01）。0.80µm MF-Milliporeメンブレンフィルターとrapid BACpro® II kitを組み合わせた前処理は、細菌同定を向上させた。 【考察・結語】 血液培養陽性ボトルから集菌を目的としたrapid BACpro® II kitの前処理キットを用い、直接同定を行うことは敗血症患者への早期治療に貢献することができる極めて有用性の高い手法であり臨床応用されている。rapid BACpro® II kitにより前処理とした細菌同定の最低検出感度は、E. coli（ATCC8739）ではスコアが2.000以上は5.0×104 CFU/mLであり、E. faecalis（ATCC19433）ではスコアが2.000以上は1.0×105 CFU/mLであった。ネコ尿検体用いてrapid BACpro® II kitにより前処理とした細菌同定では、グラム陰性菌で96.3％、グラム陽性球菌で78.5％であり、同定されなかった株は全て菌量が5.0×104 CFU/mL以下であることを報告した。本研究では、MF-Milliporeメンブレンフィルターとrapid BACpro® II kitを組み合わせた前処理法を用いることで、犬の耳漏中の微生物を高感度に同定できることを示しました。 耳漏は粘稠で濃厚な滲出液であり、細菌感染による炎症組織が含まれている。前処理に0.3µmおよび0.8µm MF-Milliporeメンブレンフィルターを用いたところ、0.3µm MF-Milliporeメンブレンフィルター表面には粘稠性が認めらたが、0.8µm MF-Milliporeメンブレンフィルター表面には粘稠性は認められなかった。耳漏検体の粘稠性を除去することにより、rapid BACpro® II kitによる細菌回収率が向上した。 耳漏検体の細菌同定における従来法では48～72時間を要する。一方、MALDI-TOF MS法は培養から24時間以内に細菌を同定できる。さらに、0.80µm MF-Milliporeメンブレンフィルターとrapid BACpro® II kitを組み合わせた前処理により処理した耳漏中の細菌は、MALDI-TOF MSを用いて約30分で同定が可能である。したがって、本方法は迅速性から細菌同定の有望な選択肢となる可能性がある。 eng doctoral thesis VoR https://az.repo.nii.ac.jp/records/2000469 乙第33号 博士（学術） 2025-09-02 32701 麻布大学 https://az.repo.nii.ac.jp/record/2000469/files/diss_de_otsu0033.pdf application/pdf 372 KB 2025-10-01 https://az.repo.nii.ac.jp/record/2000469/files/diss_de_otsu0033_jab&rev.pdf application/pdf 218 KB 2025-10-01